溶胶_凝胶技术固定化酶在生物传感器中的应用

广西轻工业
GUANGXI JOURNAL OF LIGHT INDUSTRY
2009年6月第6期（总第127期）
食品与生物
【作者简介】袁宁宁（1980-），女，硕士，研究方向：化工工艺。

现代溶胶凝胶技术的研究始于二十世纪中叶，利用溶胶和凝胶制备单组分化合物。

到六十年代末期和七十年代早期，由于电子学、
通讯技术、能源技术及其他高技术领域对新材料的要求越来越高，溶胶—凝胶技术开始进入突飞猛进的发展阶段。

溶胶—凝胶过程是指将烷氧金属或金属盐等前驱物在一定条件下水解缩合成溶胶（Sol ），然后经溶剂挥发或加热等处理使溶胶转
化为网状结构的氧化物凝胶（Gel ）的过程[1，2]，其特点是可在室温
或略高于室温的温和条件下将聚合物溶解在无机物的前驱体溶液中,在聚合物存在的条件下,使前驱体水解、聚合形成SiO 2网络或使聚合物单体和无机物前驱体同步发生聚合而获得有机无机交织网络[3]。

其相微区尺寸在纳米尺寸范围内,紧密结合或相互贯穿于小的微区尺寸,使材料具有更高的透明性[4]。

正是这些优点，使sol-gel 技术在固定生物分子、生物传感器等领域，应用非常广泛[5]。

１固定化酶
近年来生物分子固定化技术—直是生物、化工、制药等领域研究的热点之一。

固定化生物分子的种类繁多，由最初的蛋白质逐渐扩展到酶、
多肽、氨基酸、DNA 、RNA 、抗体等具有生物活性的分子[6]。

对于具有生物催化活性的酶，酶蛋白分子的活性中心是酶的催化功能所必须的，酶蛋白分子的空间构型与其活性也密切相关，因此，在酶的固定化过程中，必须注意酶活性中心的氨基酸残基不发生变化，也就是酶与载体的结合部位不应该是酶蛋白分子的活性部位，否则将导致酶蛋白分子的活性失活。

由于酶蛋白分子的高级结构是凭借氢键、
疏水键或离子键等较弱的键维持的，所以固定化时应尽可能采用温和的条件，尽可能保护好酶蛋白分子的活性基团[7]。

图1溶胶—凝胶法包埋生物分子过程
溶胶—凝胶法包埋生物分子过程是利用前驱体正硅酸酯水解、
缩聚后形成凝胶网络，生物分子在凝胶形成过程中被包囊于其中。

水解反应通常是在酸或碱的催化下完成的，然后再存放过程中，经过几天或者几周的老化，在凝胶化反应过程中产生的水和醇会从凝胶体系中挥发，结构发生坍塌，孔径缩小到2-20nm ，孔体积也比原来减小85%[8]。

因此，从研究的结果来看，大多数酶在固定化以后，它们的活性低于相同条件下溶液酶的活性。

有报道[9]指出，酸性磷酸酶、碱性磷酸酶及胰蛋白酶经溶胶—凝胶法固定化后的酶活性为溶液酶活性的30%-60%。

Li [10]等发现，溶胶—凝胶法固定化后的乳酸脱氢酶的酶活性为溶液酶活性的10%左右。

另外，底物和产物的扩散速率也普遍较低[11]，底物与酶的不易接触[12]，影响酶反应效率。

２生物传感器
生物传感器是指生物活性材料与物理换能器的结合体，它能将生物反应信息转换为可测量的光、
电等信号，从而用于物质浓度测定或反应过程研究。

传感器探头结合生物反应灵敏度高、特异性强、响应速度快和生物器件易微型化、集成化的优点，因而生物传感器技术是现场检测、在线跟踪、活体测定的理想选择。

生物传感器的传感原理如图2所示。

被测定物质经过扩散作用进入固定化生物敏感膜层，在膜层内所发生的特异性结合或催化作用被相应的物理换能器转变为物理信号，再经过检测仪放大输出，便可知道被测物浓度。

图2生物传感器的传感原理
生物敏感膜又称为识别元件，是生物传感器的关键组成部分，是生物传感器进行选择性检测的基础。

其所含生物组分可以是酶、抗体、受体、核酸、细胞及器官等[13,14]。

近些年来，随着微生物固定化技术地不断发展，各类新型生物传感器不断涌现，产生了微生物电极传感器。

在生物传感器的设计与应用中,修饰及固定化材料和敏感膜的构建方法是研制性能优良的修饰
电极和生物传感器的关键，选择合适的方法固定生物单元，可以大大提高生物单元的稳定性。

溶胶—凝胶法在固定化生物分
溶胶－凝胶技术固定化酶在生物传感器中的应用
袁宁宁，陈运藻，谢鹏波，欧阳英，王丽芳，李广益
（广州工程技术职业学院，广东广州510075）
【摘
要】溶胶—凝胶技术以其高效、
简便、通用性强等特点而越来越广泛地应用于生物分子的固定化，所得生物活性材料在生物催化、生物传感、生物医学诊断等领域具有良好的应用前景。

主要介绍了溶胶—凝胶法包埋生物分子的基本过程，及其在酶生物传感器中的应用进展。

【关键词】溶胶—凝胶；固定化酶；生物传感器【中图分类号】O629.8【文献标识码】A
【文章编号】1003-2673(2009)06－07－02
子良好表现，因此在生物传感器的修饰上也受到人们的关注。

目前，溶胶-凝胶法制备的生物传感器主要有两种：电化学传感器和光化学传感器。

2.1电化学传感器
电化学生物传感器可分为电位型和安培型两种：电位型电化学酶生物传感器因受基础电极的种类少和检出限相对较低的影响，其被研究和应用的范围受到了限制，而安培型电化学酶生物传感器因具有灵敏度高、检出限低、线性范围宽、测定类型多、电极制作多样化和易于与其他技术相结合等特点，在研究和应用中占有绝对的优势并居主流地位。

2.1.1葡萄糖传感器
对于所有包埋在Sol-gel玻璃中的酶和蛋白质，葡萄糖氧化酶（GOD）最常见。

因为价廉，稳定性好，而且在临床上对于血糖，尿糖等多种疾病的诊断具有重要意义。

Tatsu[15]利用正硅酸乙酯为前驱体，通过溶胶—凝胶法制备了含有GOD酶电极，研究了包埋GOD的回收率、酶活性与老化时间的关系，发现被包埋GOD的回收率随时间的延长而增大，并随老化温度的降低回收率降低。

使用流动注射分析葡萄糖时,响应时间为4min，检测限为400mg/dL。

李彤[16]等将普鲁士蓝(PB)修饰玻碳电极与二氧化硅Sol-gel固定化酶技术结合研制出具有“三明治”式结构的GOD电极。

考察了酶电极对葡萄糖的电化学响应及操作条件，灵敏度高达1.182μA/mmol/L，检出限为0.02 mmol/L，稳定性好，45d其响应值仍保持90%。

2.1.2过氧化氢安培型传感器
Miao[17]等为了增加修饰电极膜的韧性，在TEOS溶胶中加入壳聚糖，用于固定HRP，以铁氰化钾为电子媒介体，在检测双氧水时表现出良好的灵敏性，电极响应在10秒以内，测定双氧水范围为2.5×10-4到3.4×10-3mol/L。

Bright[18]对比研究了GOD三种固化方式即物理吸附、掺入到TEOS的溶胶-凝胶液中及将GOD夹心于两层溶胶凝胶膜中，结果表明酶在夹心式固化结构中的活性比物理吸附高5-6倍，稳定性比包埋法高3倍。

夹心式的GOD电极响应时间为30s，检出限可低至0.12 mmol/L。

2.1.3胆固醇传感器
Kumar[19]研究小组将ChOx和HRP的混合液夹心于两层溶胶-凝胶膜中，在选定的试验条件下对ChOx的响应时间为50s、线性范围为2~10mmol/L，检出限0.5mmol/L。

所制酶传感器在4~5℃可稳定12周。

宋昭等[20]以纳米碳管修饰铂电极为基础电极，采用Sol-gel法固定胆碱氧化酶，构建了电流型胆碱检测生物传感器，所制备的传感器在pH7.2，电位为0.15 V条件下对氯化胆碱的线性响应范围为5.0×10-6~1.0×10-4 mol/L，检出限为5.0×10-7mol/L；且制成的生物传感器具有灵敏度高，稳定性好，抗干扰能力强等特点。

2.2光化学传感器
溶胶-凝胶膜具有良好的光透性，反应信号可以通过光学检测器来定量检测。

各种检测方法包括紫外—可见吸收、激发荧光、抑止荧光、室温磷光、化学发光都已用于检测溶胶—凝胶光化学传感器。

目前研究最多的是葡萄糖氧化酶光学传感器，属于葡萄糖氧化酶能够催化O2氧化D-葡萄糖为葡萄糖酮和葡萄糖酸，并生成双氧水，双氧水在过氧化酶的催化下氧化有机染料，通过吸收光谱的变化测定葡萄糖的含量。

经将包埋有葡萄糖氧化酶的溶胶—凝胶玻璃浸入含有变胺蓝和葡萄糖的溶液中，得到的蓝色玻璃颜色均匀，表明酶活力分布于整个溶胶-凝胶玻璃中，在玻璃中染料的光学光谱与溶液中一致，且吸光度随葡萄糖浓度的增大而增加，用这种方法测定葡萄糖的浓度为1~100 mmol/L，传感器可连续使用6个月[21]。

Williams[22]等利用醇脱氢酶（ADH）在使乙醇和乙醛转化的过程中，其辅因子NAD和NADH转化而引起荧光强度的变化设计了传感器，测定短链醇和醛。

Ellerby[23，24]等最先利用溶胶-凝胶法将肌红蛋白和血红蛋白（Hb）包埋与透明的二氧化硅玻璃中，活性研究发现蛋白质对小分子（NO、CO、O2）依然具有键合能力，键合后的UV-Vis光谱和位置与在水溶液中的基本一致。

Barrero[25]用硅凝胶固定的pyoverdin荧光法分析了Fe3+,实验中没有发现试剂的泄漏,且其稳定性在溶胶凝胶基底中得到了增强。

采用流动注射分析的最低检测限可达20mmol/L，响应快。

并成功用于了自来水及血清中铁的测定,测定结果可以与原子吸收法相媲美。

此外，B right研究小组[26]也尝试着用溶胶凝胶法固化了抗荧光性的抗体,发现固化后的抗体与荧光染料间仍具亲和性。

荧光分析的结果表明该亲和反应的亲和常数的数量级为107mmol/L。

３结语
由于sol-gel制备工艺简单，溶胶凝胶的物理化学性质如孔径、粘度、密度、成型形状、化学组成、比表面积、导电性、亲水性、机械强度等易于控制，加之其优异的光学透过性能，必将为今后的生物组份固化技术、生物传感器的制备提供更多的机会和条件。

但由于Sol-gel在p H较高时易水解、使用中易脆裂损坏、稳定性差、使用时间短，因此对溶胶-凝胶包囊化生物分子在生物电极、生物催化剂、生物传感器、生物检测等领域的广泛应用进行深入研究。

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甙溶液，从第二个排出口送出，经真空干燥得罗汉果甜甙产品。

（7）剩余滤液通过第三重膜，罗汉果多糖及微量元素被截留分离，从第三个排出口送出，经真空干燥得罗汉果副产品用于食品糕点制作。

４材料和方法
4.1实验材料和主要仪器设备
原材料：鲜罗汉果采自罗汉果起源地桂林永福县龙江乡，属原产地果实；
主要仪器设备：提取罐、预处理装置、膜分离组件及其配套设备。

4.2实验内容
称取鲜罗汉果2000克，破碎至2-3厘米碎片，加入6公斤水，煮3~5小时，反复3次以上，至果渣无甜度为止；将罗汉果混合料液粗滤后送入预处理装置（果渣回收利用），料液的PH=5，经预处理的料液在压力泵0.01~0.04MPa 工作压力下被送入第一级膜组件。

料液通过第一重膜，
截留分离出浓缩的罗汉果纤维、蛋白、果胶和杂质共160克，从第一个排出口送出，可制作有机肥料或用其提取其它有效成分；剩余料液在第二个压力泵0.01~0.08MPa 工作压力下被送入第二级膜组件。

通过第二重膜，截留分离出浓缩的罗汉果甜甙溶液（浓度为28波美度），从第二个排出口送出，经真空干燥（温度40-75℃），得罗汉果甜甙36克，化验其中总甙含量86%；最后剩余料液经第三个压力泵在0.01~0.15Mpa 工作压力下送入第三级膜组件。

通过第三重膜，最后截留分离出罗汉果果糖和微量元素。

4.3鉴定与分析
罗汉果甜甙颜色：浅黄色粉末；气味：特有的罗汉果清香味；水溶性：易溶入水；经检测重金属含量和微生物指标均符合
企业标准。

５结论
（1）结果表明，本工艺提取罗汉果甜甙，分离、提取和浓缩一次完成，工艺简单，且可连续生产，产品质量好，收率高，无污染，不产生废水，设备简单，投资少。

该工艺比较适合在罗汉果甜甙、罗汉果浸膏、罗汉果饮料等制品中的应用。

但由于罗汉果浸出液含有较多杂质和较强的粘性，直接用膜来分离未处理的罗汉果料液会造成膜的严重污染，料液的渗透量会下降，会延长工作时间，降低膜的寿命。

因此，膜件的选择和料液的预处理是保证分离和质量的关键。

（2）罗汉果是集营养、保健功能为一体的药食两用植物，全身都是宝，由于技术原因，其相当多的资源没有被开发和利用，用膜分离技术提取罗汉果中的有效成分，还处于初级发展阶段。

所以，需要研究的课题很多，罗汉果综合利用的前景十分广阔。

随着罗汉果这一特产资源的保健和医药功能被不断认识以及膜技术在罗汉果提取工艺中的应用，罗汉果系列产品的研发已逐渐受到更多学者的关注。

因此，推广和应用膜技术在提取罗汉果甜甙工艺中的应用，有着重大的现实意义。

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