紫外可见吸光光度法及分子荧光分析法

~3.0 ×108m/s
－波长，单位：m, cm, mm, m, nm, Å
1m=10-6m, 1nm=10-9m, 1Å=10-10m
－频率，单位：赫芝(周)Hz 次/秒
n －折射率，真空中为1
8
9
光学光谱区
远紫外 近紫外 可见 近红外 中红外
（真空紫外）
远红外
10nm~200nm 200nm 380nm 780 nm ~380nm ~ 780nm ~ 2.5 m
εmax为: 1×104 L·mol-1·cm－1。
⑷ n →π＊跃迁
需能量最低，吸收波长λ>200nm。这类跃迁在跃迁选律上属于禁阻跃 迁，摩尔吸光系数一般为10～100 L·mol-1·cm-1，吸收谱带强度较弱。 分子中孤对电子和π键同时存在时发生n →π＊ 跃迁。丙酮n →π＊跃迁 的λ为275nm εmax为22 L·mol-1 ·cm -1（溶剂环己烷)。
分子轨道理论：一个成 键轨道必定有一个相应的反 键轨道。通常外层电子均处 于分子轨道的基态，即成键 轨道或非键轨道上。
外层电子吸收紫外或可见辐射后，就从基态向激发态
(反键轨道)跃迁。主要有四种跃迁所需能量ΔΕ大小顺序为：
n→π＊ < π→π＊ < n→σ＊ < σ→σ＊
⑴ ς→ς＊跃迁
所需能量最大，σ电子只有吸收远紫外光的能量才能发生跃迁。饱和 烷烃的分子吸收光谱出现在远紫外区(吸收波长λ<200nm，只能被真空紫 外分光光度计检测到)。如甲烷的λ为125nm,乙烷λmax为135nm。
假设由波长为λ1和λ2的两单色光 组成的入射光通过浓度为c的溶液，则：
A 1＝lg（Ｉo1 /Ｉt1 ）＝ε1bc A 2＝lg(Ｉo2 /Ｉt2 ）＝ε2bc
故： It1 IO1 10ε 1bc ; It2 IO1 10ε 2bc
式中：Ｉo1、Ｉo2分别为λ1、λ2 的入射光强度； Ｉt1、Ｉt2分别为λ1、λ2 的透射光强度；
ε=(6～10）×104 ：高灵敏； ε<2×104 ：不灵敏。 （6）ε在数值上等于浓度为1mol/L、液层厚度为1cm时该溶 液在某一波长下的吸光度。
吸光度A、透射比T与浓度c 的关系
A
T (%)
1.0
100
0.8 T = 10-kbc
80
0.6
A=kbc 60
0.4
40
0.2
20
c
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朗伯-比尔定律的适用条件
光吸收基本定律:朗伯-比尔定律
朗伯定律:(1760) A=lg(I0/It)=k1b 当入射光的 ,吸光物质的c 一定时,溶液的吸光度A与
液层厚度b成正比.
比尔定律(1852) A=lg(I0/It)=k2c 当入射光的 ,液层厚度b 一定时,溶液的吸光度A与
吸光物质的c成正比.
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A=lg(I0/It)=kbc
浓度无关； （3）可作为定性鉴定的参数； （4）同一吸收物质在不同波长下的ε值是不同的。在最大吸 收波长λmax处的摩尔吸光系数，常以εmax表示。εmax表明了 该吸收物质最大限度的吸光能力，也反映了光度法测定该物 质可能达到的最大灵敏度。
（5）εmax越大表明该物质的吸光能力越强，用光度法测定 该物质的灵敏度越高。ε>105：超高灵敏；
12
固体的颜色
• 对固体物质来说，当白光照射到物质上时， 物质对于不同波长的光线吸收、透过、反射、 折射的程度不同而使物质呈现出不同的颜色。 如果物质对各种波长的光完全吸收，则呈现黑 色；如果完全反射，则呈现白色；如果对各种 波长的光吸收程度差不多，则呈现灰色；如果 物质选择性地吸收某些波长的光，那么，这种 物质的颜色就由它所反射或透过光的颜色来决 定。
⑵ n→σ＊跃迁
所需能量较大。吸收波长为150～250nm，大部分在远紫外区，近紫 外区仍不易观察到。含非键电子的饱和烃衍生物(含N、O、S和卤素等杂 原子)均呈现n →σ*跃迁。如一氯甲烷、甲醇、三甲基胺n →σ*跃迁 的λ分别为173nm、183nm和227nm。
⑶ π→π＊跃迁
所需能量较小，吸收波长处于远紫外区的近紫外端或近紫外区，摩尔 吸光系数εmax一般在104 L·mol－1·cm－1以上，属于强吸收。不饱和烃、 共轭烯烃和芳香烃类均可发生该类跃迁。如：乙烯π→π*跃迁的λ为162 nm，
互补光
不同颜色的可见光波长及其互补光
/nm 400 ～ 450
450 ～ 480 480 ～ 490 490 ～ 500 500 ～ 560 560 ～ 580 580 ～ 610 610 ～ 650 650 ～ 760
颜色 紫
蓝 绿蓝 蓝绿
绿 黄绿
黄 橙 红
互补光 黄绿
黄 橙 红 红紫 紫 蓝 绿蓝 蓝绿
lg(1＋10 bc )值随c值增大而增大，则标准曲线偏离 直线向c 轴弯曲，即负偏离；反之，则向A轴弯曲，即正偏 离。
讨论:
A总 =A1 + lg2 - lg(1＋10－εbc )
(3) ｜ ｜很小时，即ε1≈ε2：
可近似认为是单色光。在低浓度范围内，不发生偏离。若
浓度较高，即使｜ ｜很小， A总 ≠Ａ1 ，且随着c值增大，
吸收曲线的讨论：
（1）同一种物质对不同波长光的吸光度不 同。吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长 λmax
（2）不同浓度的同一种物质，其吸收曲线 形状相似λmax不变。而对于不同物质，它们的 吸收曲线形状和λmax则不同。
（3）③吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物质定性分析的依 据之一。
1. 单色光
应选用max处或肩峰处测定.
2. 吸光质点形式不变
离解、络合、缔合会破坏线性关系, 应控制条件(酸度、浓度、介质等).
3. 稀溶液
浓度增大，分子之间作用增强.
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朗伯-比尔定律的分析应用
溶液浓度的测定
A
0.80
A＝ b c
Ax 0.60
*
0.40
工作曲线法 (校准曲线)
0.20
0.00
1. 光谱种类
原子光谱：吸收、发射、荧光
线状光谱
分子光谱：紫外、可见、红外等吸收光谱
I
带状光谱
黑体辐射：白炽灯、液、固灼热发光 连续光谱
2.光谱学应用
天文学应用
天体光谱学(astrospectroscopy)：研究天体的连续光谱 和谱线的形成与变化机制以揭示天体的化学成分和物理 状态.
物理学和化学中的应用
0
1.0 2.0
cx 3.0 4.0 c(mg/mL)
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偏离朗伯—比耳定律的原因
标准曲线法测定未知溶液的浓度时，发现：标准曲线 常发生弯曲（尤其当溶液浓度较高时），这种现象称为对 朗伯—比耳定律的偏离。
引起这种偏离的因素（两大类）： （1）物理性因素，即仪器的非理想引起的； （2）化学性因素。
分子具有三种不同能级：电子能级、振动能级和转动能级 三种能级都是量子化（quantization）的，且各自具有相应 的能量 分子的内能：电子能量Ee 、振动能量Ev 、转动能量Er
即 E＝Ee+Ev+Er ΔΕe>ΔΕv>ΔΕr
能级跃迁
紫外-可见光谱属于电子 跃迁光谱。
电子能级间跃迁的同时 总伴随有振动和转动能级间 的跃迁。即电子光谱中总包 含有振动能级和转动能级间 跃迁产生的若干谱线而呈现 宽谱带。
ε1、ε2分别为λ1、λ2的摩尔吸光系数；
因实际上只能测总吸光度A总，并不能分别测得
A1和A2，故：
A总 ＝ lg（Ｉo总/Ｉt总 ) ＝lg(Io1+Ｉo2)/(Ｉt1+Ｉt2） ＝ lg(Io1+Ｉo2)/(Ｉo110-ε1bc +Ｉo210-ε2bc ）
令： ε1-ε2 ＝ ； 设： Ｉo1 ＝Ｉo2
微波
0.1~100cm 跃迁、自旋跃迁
无线电波 1~1000m 核自旋跃迁
光谱类型 X射线谱 电子光谱
电子光谱 电子光谱 红外光谱 微波谱、顺磁共振 核磁共振
1.2 紫外可见光谱
1.基础知识
光的基本性质（波动性和粒子性）
光的传播速度:
V = c =
n
c －真空中光速 2.99792458×108m/s
它们本身没有生色功能(不能吸收λ>200nm的光)，但当它们与生色团相 连时，就会发生n—π共轭作用，增强生色团的生色能力(吸收波长向长波 方向移动，且吸收强度增加)，这样的基团称为助色团。
红移与蓝移
有机化合物的吸收谱带常常因 引入取代基或改变溶剂使最大吸收
波长λmax和吸收强度发生变化: λmax向长波方向移动称为红移，
利用光谱学对各种物质的物理化学性质进行研究
光谱学
地质学应用
利用光谱学对各种地质样品进行相关研究
。。。。。。
辐射区域 波长
分子运动
X射线 0.1~10nm 内层电子跃迁
真空紫外 10~200nm 外层电子跃迁
紫外
200~400nm 外层电子跃迁
可见
400~800nm 外层电子跃迁
红外
0.8~1000μm 振动与转动跃迁
意义: 当一束平行单色光通过均匀、透明的吸光介
质时，其吸光度与吸光质点的浓度和吸收层厚度 的乘积成正比.
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当c的单位用g·L-1表示时1
当c的单位用mol·L-1表示时，用 表示. －摩尔吸光系数 Molar Absorptivity
（4）不同浓度的同一种物质，在某一定波长下吸光度 A 有差异，在
λmax处吸光度A 的差异最大。此特性可作为物质定量分析的依据。
（5）在λmax处吸光度随浓度变化的幅度最大，所以测定最灵敏。吸
收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据。
2. 物质对光的吸收与能级
分子内部分子运动
物质分子内部三种运动形式： （1）电子相对于原子核的运动 （2）原子核在其平衡位置附近的相对振动 （3）分子本身绕其重心的转动
（1）物理性因素
难以获得真正的纯单色光。 朗—比耳定律的前提条件之一是入射光为单色光。
分光光度计只能获得近乎单色的狭窄光带。复合光可导 致对朗伯—比耳定律的正或负偏离。
非单色光、杂散光、非平行入射 光都会引起对朗伯—比耳定律的偏离， 最主要的是非单色光作为入射光引起 的偏离。
非单色光作为入射光引起的偏离
A＝ b c
的单位: L·mol-1·cm-1
当 A＝c的E单11c%m位b用c，g·1E0110c%mm 叫L-1做表比示吸时光，系用数E.11c%m 表示,
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摩尔吸光系数ε的讨论
（1）吸收物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数；
（2）不随浓度c和光程长度b的改变而改变。在温度和波长 等条件一定时，ε仅与吸收物质本身的性质有关，与待测物
紫外吸收光谱
• 共轭双键结构的分子。如胆甾 酮（a）与异亚丙基丙酮（b） 分子结构差异很大，但两者具 有相似的紫外吸收峰。两分子 中相同的O=C-C=C共轭结构是 产生紫外吸收的关键基团。
紫外可见光谱与电子跃迁
有机化合物的紫外—可见吸收光谱，是其分子中外层价电子
跃迁的结果（三种）：σ电子、π电子、n电子。
生色团与助色团
生色团： 最有用的紫外—可见光谱是由π→π＊和n→π＊跃迁产生的。这两种
跃迁均要求有机物分子中含有不饱和基团。这类含有π键的不饱和基团称 为生色团。简单的生色团由双键或叁键体系组成，如乙烯基、羰基、亚 硝基、偶氮基—N＝N—、乙炔基、腈基—C㆔N等。
助色团： 有一些含有n电子的基团(如—OH、—OR、—NH２、—NHR、—X等)，
A总 ＝ lg(2Io1)/Ｉt1(1＋10 - εbc ）
＝ A 1 + lg2 - lg(1＋10 - εbc )
讨论:
A总 =A1 + lg2 - lg(1＋10－εbc )
(1) = 0； 即： 1= 2 =
则： A总 ＝lg（Ｉo/Ｉt）＝ bc
(2) ≠0 若 <0 ；即 2< 1 ； － bc>0,
向短波方向移动称为蓝移 (或紫
移)。吸收强度即摩尔吸光系数ε
增大或减小的现象分别称为增色效 应或减色效应，如图所示。
物质对光的吸收
分光光度法的 应用：定量测 定与定性分析
I0
It
测量光强
度的减弱
物质对光有选择性 吸收
— 准备知识
光强的减弱与物 质浓度的关系？
—朗伯-比尔定律
3. 朗伯-比尔定律
2.5 m ~ 50 m
50 m ~300 m
10
物质对光的选择性吸收及吸收曲线
M + h M*
M +热
基态
激发态
M + 荧光或磷光
E1 （△E） E2
E = E2 - E1 = h
量子化 ；选择性吸收;
分子结构的复杂性使其对不同波 长光的吸收程度不同；
用不同波长的单色光照射，测吸
光度— 吸收曲线与最大吸收波长 max； 光的互补：蓝➢ 黄