食品分析与检验重要实验讲解

实验一：食品中亚硝酸盐的测定
一、实验目的
1. 掌握盐酸萘乙二胺比色法测定亚硝酸盐的原理
2. 掌握分光光度计的使用、标准曲线的绘制及计算方法
3. 了解分光光度计的构造
二、实验原理
样品经沉淀蛋白质，除去脂肪后，在弱酸条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化，再与盐酸萘乙二胺偶合形成紫红色染料，其最大吸收波长为538 nm，可测定吸光度并与标准比较定量。

三、仪器与试剂
1. 仪器
（1）分光光度计
（2）小型胶肉机
（3）恒温水浴锅
2．试剂
（1）亚铁氰化钾溶液(106g/L)：称取106.0g亚铁氰化钾，用水溶解，并稀释至1000 mL。

（2）乙酸锌溶液(220g/L)：称取220.0 g乙酸锌，先加30mL冰醋酸溶解，用水稀释至1000 mL。

（3）饱和硼砂溶液(50g/L)：称取5.0g硼酸钠，溶于100mL热水中，冷却后备用。

（4）对氨基苯磺酸溶液（4g/L）：称取0.4ｇ对氨基苯磺酸，溶于100mL20 %（V/V）盐酸中，置棕色瓶中混匀，避光保存。

（5）盐酸萘乙二胺溶液（2g/L）：称取0.2g盐酸萘乙二胺，溶于100mL水中, 混匀后，置棕色瓶中，避光保存。

（6）亚硝酸钠标准溶液（200μg/mL）：准确称取0.1000ｇ于110℃～120℃干燥恒重的亚硝酸钠，加水溶解移入500mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。

（7）亚硝酸钠标准使用液（5.0 μg/mL）：临用前，吸取亚硝酸钠标准溶液5.00mL，置于200mL容量瓶中，加水稀释至刻度。

四、实验步骤
1. 提取
称取2.50g经绞碎混匀的样品，于50mL烧杯中，加硼砂饱和溶液12.5mL饱和硼砂溶液，搅拌均匀，以70℃左右的水约300 mL 将试样洗入500mL容量瓶中，于沸水浴中加热15min，取出置冷水浴中冷却，并放置至室温。

2. 提取液净化
在振荡上述提取液时加入5 mL 亚铁氰化钾溶液, 摇匀, 再加入5mL乙酸锌溶液，以沉淀蛋白质。

加水至刻度, 摇匀, 放置30min, 除去上层脂肪, 上清液用滤纸过滤, 弃去初滤液30mL，滤液备用。

五、结果计算
1. 绘制标准曲线
以亚硝酸钠量（μg）为横坐标，与其对应的吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

2. 用样品提取液的吸光度，在以上亚硝酸钠标准曲线上查出亚硝酸钠的量(μg)。

3. 计算
m’×1000
X= —————————
V2
m ×——×1000
V1
式中：X——样品中亚硝酸盐的含量，mg/kg；
m’——测定用样液中亚硝酸钠的含量，μg；
m——样品的质量，g
V1——样液总体积mL
V2——测定用样液体积mL
六. 思考题
1. 若从标准曲线上查不到滤液所相当的亚硝酸钠量（即大于10μg）是，如何改进本实验？
2. 采用回归方程计算与从校正曲线直接求得亚硝酸钠的含量，各有什么优缺点？
3. 紫外可见分光光度计由哪几部分组成，每个主要部分的作用是什么？
4. 使用紫外可见分光光度计时，应注意哪些问题？
实验二：茶饮料中茶多酚的测定
一、实验目的
1. 掌握分光光度计法测定茶饮料中茶多酚的基本原理和操作程序。

2．掌握分光光度计的使用及计算方法
二、实验原理
茶饮料中的多酚类物质能与亚铁离于形成紫蓝色络合物，用分光光度计法测定其含量。

三、仪器与试剂
1. 仪器
（1）分析天平：感量0.001g。

（2）分光光度计。

2. 试剂
所用试剂均为分析纯(AR)；试验用水应符合GB/T 6682中的三级水规格。

（1）酒石酸亚铁溶液：称取硫酸亚铁0.1g和酒石酸钾钠0.5g，用水溶解并定容至100mL(低温保存有效期10天)。

（2）pH7.5磷酸缓冲溶液
A. 23.87 g/L磷酸氢二钠：称取磷酸氢二钠23.87 g加水溶解后定容至1 L。

B. 9.08g/L磷酸二氢钾：称取经110℃烘干2h的磷酸二氢钾9.08g，加水溶解后定容至1L。

取上述磷酸氢二钠溶液85mL和磷酸二氢钾溶液15mL混合均匀。

四、实验步骤
1. 试液制备
（1）含二氧化碳茶饮料
量取充分混匀的样液100mL于250mL烧杯中，称取其总质量，然后置于电炉上加热至沸，在微沸状态下加热10min，将二氧化碳气排除。

冷却后，用水补足其原来的质量。

摇匀后，备用。

（2）茶叶
称取3g磨碎样品于500mL锥形瓶中，加入热蒸馏水450mL,立即移入沸水浴中浸提45min（每隔10min摇动一次）浸提完毕后，立即趁热减压过滤。

滤液移入500mL 容量瓶中，残渣用少量热蒸馏水洗涤2-3次，并将滤液滤入上述容量瓶中，冷却后，用蒸馏水稀释至刻度。

2.测定
（1）茶饮料
精确移取上述制备的试液1 mL～5 mL于25 mL容量瓶中，加水4 mL、酒石酸亚铁溶液5mL，充分摇匀，用pH7.5磷酸缓冲溶液定容至刻度。

用10mm比色皿，在波长540nm处，以试剂空白作参比，测定其吸光度(A1)。

同时移取等量的试液于25mL 容量瓶中，加水4mL，用pH7.5的磷酸缓冲液定容至刻度，测定其吸光度(A2)。

（2）茶叶
精确移取上述制备的试液1 mL于25 mL容量瓶中，加水4 mL、酒石酸亚铁溶液5mL，充分摇匀，用pH7.5磷酸缓冲溶液定容至刻度。

用10mm比色皿，在波长540nm 处，以试剂空白作参比，测定其吸光度(A)。

五、结果计算
1. 数据记录
2. 计算
(1)茶饮料中茶多酚含量计算公式
(A1- A2)×1.957×2×K
X= ———————————×1000
m
式中： X——样品中茶多酚的含量，mg/kg;
A1——试液显色后的吸光度；
A2——试液底色的吸光度；
K——稀释倍数；
m ——测定时称取试样的质量，g；
1.957——用10mm比色皿，当吸光度等于0.50时，1mL茶汤中茶多酚的含量相当于1.957mg。

（2）茶叶中茶多酚含量计算公式
A×1.957×2 V1
X(%)= ————————×————×100
100 V2×M
X——样品中茶多酚的含量，%
A——试样溶液的吸光度；
M——称取试样的质量，g
V1——试样溶液的总体积，mL
V2——测定用试样溶液的体积，mL
1.957——用10mm比色皿，当吸光度等于0.50时，1mL茶汤中茶多酚的含量相当于1.957mg。

六. 思考题
1. 若实验室无10mm比色皿，可否用1mm比色皿进行测定，若可以，结果计算公式将作何变化。

实验三：火焰原子吸收光谱法测定食品中的铜
一、实验目的
1. 通过对铜最佳测定条件的选择，了解与火焰性质有关的一些条件参数对铜测定灵敏度的影响；
2. 了解原子吸收分光光度计的基本结构和原理；
3. 掌握火焰原子吸收光谱分析的基本操作；学习食品中铜含量的测定方法。

4. 熟悉和掌握原子吸收分光光度法的定量分析方法
5. 学习微波消解仪在样品前处理中的应用
二、实验原理
样品处理后，导入原子吸收分光光度计中，原子化以后，吸收324.8共振线，其吸收量与铜含量成正比，与标准系列比较定量。

三、仪器与试剂
1. 仪器
（1）原子吸收分光光度计（附铜空心阴极灯）
（2）微波消解仪
2. 试剂
除非另有规定，本方法所使用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682 规定的一级水。

（1）硝酸：优级纯
（2）过氧化氢（30%）
（3）硝酸：1+99
（4）6mol/L硝酸：量取60 mL硝酸，加水稀释至160mL。

（5）铜的标准储备液(1000μg/mL)：称取 1.000克金属铜（99.99%），分次加入6mol/L硝酸溶解，总量不超过37mL，移1000 mL容量瓶中，用水稀释至刻度。

可以直接购买该元素的有证国家标准物质作为标准溶液
（6）铜标准使用液：将铜标准储备液用硝酸（1+199）溶液稀释，配制成浓度为0.4、
0.8、1.0、2.0、3.0、4.0mg/L的标准使用液。

四、实验步骤
1. 原子吸收光谱仪分析参考条件
测定波长：324.8nm 灯电流：6mA 狭缝：0.19nm
空气流量：9L/min 乙炔流量：2L/min 灯头高度：3mm
背景校正：氘灯
可根据仪器情况调至最佳状态。

2. 样品消化
称取0.10g～0.50g 试样于消解罐内，加硝酸5mL,1～2mL30%的过氧化氢，盖好安全阀后，将消解罐放入微波炉消解系统中，选择合适的消解条件进行消解，至消解完全，转移到25 mL容量瓶中, 用硝酸（1+199）定容至刻度。

同时作试剂空白。

3. 样品测量
将标准溶液、空白溶液和样品溶液依次喷入火焰，测量吸光度。

4. 绘制标准曲线并查出样液铜元素的浓度。

五、结果计算
2. 计算
C×V
X (mg/㎏)= -----------
m
X－试样中铜的含量（mg/kg）；
C－样品中检测物浓度，mg/L
V－样品体积，mL
m－样品质量，g
计算结果保留两位有效数字。

六、思考题
1. 原子吸收光谱仪由哪几部分组成，每个主要部分的作用是什么？
2. 在原子吸收分析中，为什么常选用共振线作为吸收线？
3. 原子吸收定量分析的依据是什么？进行定量分析有哪些方法？试比较它们的优缺点。

实验四：食品中甜蜜素的测定
一、实验目的
1. 了解气相色谱仪的使用方法；
2. 了解气相色谱仪的基本结构和原理；
3．学习食品中甜蜜素的气相色谱测定方法。

二、实验原理
在硫酸介质中环己基氨基磺酸钠与亚硝酸反应，生成环己醇亚硝酸酯，利用气相色谱法进行定性和定量。

三、仪器与试剂
1. 仪器
（1）气相色谱仪附氢火焰离子化检测器。

（2）旋涡混合器。

（3）离心机。

（4）10μL微量注射器。

（5）DB-5毛细管柱30m×0.53mm×0.25μm
2. 试剂
（1）正己烷
（2）氯化钠
（3）层析硅胶(或海砂)。

（4）50g/L亚硝酸钠溶液
（5）100g/L硫酸溶液。

（6）环己基氨基磺酸钠标准溶液：精确称取1.0000g环己基氨基磺酸钠，加水溶解并定容至100mL，此溶液每毫升含环己基氨基磺酸钠10mg。

四、实验步骤
1、气相色谱检测样品参考条件：
（1）DB-5毛细管柱30m×0.53mm×0.25μm，或相当者。

（2）检测器温度：200℃
（3）汽化室温度：200℃
（4）炉箱温度：60℃
（5）载气流速（压力）：60kPa
（6）氢气流速（压力）：50kPa
（7）空气流速（压力）：60 kPa
2. 试样制备
称取20.0g试样于100mL带塞比色管，置冰浴中。

3. 测定
（1）标准曲线的制备：准确吸取1.00mL环己基氨基磺酸钠标准溶液于100mL带塞比色管中，加水20mL。

置冰浴中，加入5mL50g/L亚硝酸钠溶液，5mL100g/L硫酸溶液，摇匀，在冰浴中放置30min，并时常摇动，然后准确加入10mL正己烷，5g
氯化钠，摇匀后振摇80次。

待静止分层后吸出正己烷层于10mL带塞离心管中进行离心分离。

每毫升己烷提取液相当于1mg环己基氨基磺酸钠，将标准提取液进样1μL～5μL于气相色谱仪中，根据响应值绘制标准曲线。

（2）试样测定：处理过程同标准溶液前处理。

吸取的试样提取液1μL注入色谱仪进行分析。

五、结果计算
2. 计算
C×V
X (g/㎏)= -----------
m
C—样品中甜蜜素浓度，mg/mL
V－样品提取液体积，mL
m－样液质量，g
计算结果保留两位有效数字。

六、思考题
1．气相色谱仪由哪几部分组成，各有什么作用？
2．气相色谱定量分析的方法有几种？各有哪些优缺点？
实验五：乳制品中三聚氰胺的测定
一、实验目的
1. 了解HPLC仪器基本结构,掌握实验仪器的一般使用方法；
2. 加深对色谱分离原理的理解，掌握主要实验条件的选择；
3. 掌握液相色谱定性定量分析技术。

4. 掌握乳制品中三聚氰胺的测定方法
二、实验原理
试样用甲醇-水提取，过滤后进高效液相色谱仪，经反相色谱柱分离后，根据保
留时间和峰面积进行定性和定量。

三、仪器与试剂
1. 仪器
（1）高效液相色谱仪，配有紫外检测器或二极管阵列检测器
（2）分析天平：感量为0.0001 g
（3）超声波水浴
（4）涡旋混合器
2. 试剂
除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。

（1）甲醇：色谱纯
（2）乙腈：色谱纯
（3）柠檬酸
（4）辛烷磺酸钠：色谱纯
（5）离子对试剂缓冲液：准确称取2.10 g 柠檬酸和2.16 g 辛烷磺酸钠，加入约980 mL 水溶解，调节pH至3.0后，定容至1L备用。

（6）三聚氰胺标准品：CAS 108-78-01，纯度大于99.0%。

（7）三聚氰胺标准储备液：准确称取100 mg（精确到0.1 mg）三聚氰胺标准品于100 mL 容量瓶中，用甲醇水溶液（1+1）溶解并定容至刻度，配制成浓度为1 mg/mL的标准储备液，于4℃避光保存。

四、实验步骤
1、高效液相色谱检测样品参考条件：
（1）C18柱，250 mm×4.6 mm，5 μm，或相当者。

（2）流动相：乙腈+离子对试剂缓冲液(10+90) 恒量流速
（3）离子对试剂缓冲液：10mM辛烷磺酸钠+10mM柠檬酸加1000mL水定容
（4）流速：1mL/min
（5）温度：25℃
（6）进样体积：20μL
（7）检测器：DAD检测器波长236nm
根据保留时间定性，外标峰面积法定量
2. 标准曲线的制备：用流动相将三聚氰胺标准储备液稀释得到的浓度为5、10、20、40、50μg/mL的标准工作液，浓度由低到高进样检测，以峰面积-浓度作图，得到标准曲线回归方程。

3. 试样测定：称取试样2克左右样品，移入100mL容量瓶中，加入适量甲醇+水（2+8），
充分混匀，超声提取10分钟后用甲醇+水（2+8）定容至刻度，过滤，滤液过0.45μm 滤膜过滤后进液相色谱测定。

五、结果计算
2. 计算
C×V
X (mg/㎏)= -----------
m
X－试样中三聚氰胺的含量（mg/kg）；
C－样品中检测物浓度，mg/L
V－样品体积，mL
m－样品质量，g
计算结果保留两位有效数字。

六、思考题
1．高效液相色谱仪由哪几部分组成？
2．在高效液相色谱分析中，为什么要对流动相进行脱气？有哪些脱气方式？
实验六：食品中合成着色剂的测定
一、实验目的
1.掌握聚酰胺吸附法提取色素的样品前处理方法。

2. 加深对色谱分离原理的理解，掌握主要实验条件的选择；
3. 掌握液相色谱定性定量分析技术。

4. 掌握食品中人工合成色素的测定方法
二、实验原理
食品中人工合成着色剂在酸性条件下用聚酰胺吸附法或液-液分配法提取，制成水溶液，注入高效液相色谱仪，经反相色谱分离后，根据保留时间定性，与峰面积比较进行定量。

三、仪器与试剂
2. 试剂
除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。

（1）甲醇（色谱纯）：经0.45μm滤膜过滤。

（2）0.02 mol/L 乙酸铵溶液：称取1.54 g 乙酸铵，加水溶解至1000 mL，经0.45μm滤膜过滤。

（3）聚酰胺粉（尼龙6）：过200目筛。

（4）甲醇-甲酸（6+4）溶液：量取甲醇60 mL，甲酸40 mL，混匀。

（5）柠檬酸溶液：称取20g 柠檬酸，加水至100 mL，溶解混匀。

（6）无水乙醇-氨水-水（7+2+1）溶液：量取无水乙醇70 mL，氨水20 mL，水10mL，混匀。

（7）pH6的水：水加柠檬酸溶液调pH值到6。

（8）合成着色剂标准溶液：准确称取按其纯度折算为100%质量的柠檬黄、日落黄各0.100 g，置100 mL 容量瓶中，加pH 6水到刻度，配成浓度为1.00 mg/mL 的着色剂水溶液。

也可以直接购买该着色剂的有证国家标准物质作为标准溶液。

（9）合成着色剂标准使用液：临用时将上述溶液加水稀释100倍，经0.45μm 滤膜过滤，配成每毫升相当于10 μg的合成着色剂。

（10）乙酸
2. 仪器：
（1）高效液相色谱仪，配有紫外检测器或二极管阵列检测器
（2）分析天平：感量为0.0001 g
（3）电热恒温干燥箱
（4）真空泵
（5）真空抽滤瓶
（6）G3垂融漏斗
四、实验步骤
1、高效液相色谱检测样品参考条件：
（1）C18柱，250 mm×4.6 mm，5 μm，或相当者
（2）流动相：甲醇-乙酸铵溶液(PH=4.0,0.02 mol/L)
（3）梯度洗脱：甲醇：20%～35%，5min；35%～98%，5min；98% 继续6 min （4）流速：1mL/min
（5）检测波长：254nm
2. 样品处理
1、称取20.0g～40.0g,放入100mL 烧杯中，加热驱除二氧化碳。

2. 色素提取
1、聚酰胺吸附法：试样溶液加柠檬酸溶液pH值到6，加热至60℃，将1g聚酰胺粉加少许水调成粥状，倒入试样溶液中，搅拌片刻，以G3垂融漏斗抽滤，用60℃ pH=4的水洗涤3～5次，然后用甲醇-甲酸混合溶液洗涤3～5次，再用水洗至中性，用乙醇-氨水-水混合溶液解吸3～5次，每次5mL，收集解吸液，加乙酸中和，蒸发至近干，加水溶解，定容至5mL。

约0.45μm 滤膜过滤，取20μL 进高效液相色谱仪分析。

2、测定
取相同体积样液和合成着色剂标准使用液分别注入高效液相色谱仪，根据保留时间定性，外标峰面积法定量。

五、结果计算
2. 计算
C×V
X (g/㎏)= -----------------
m×1000
C—样品中检测物浓度，mg/L
V－样品体积，mL
m－样品质量，g
计算结果保留两位有效数字。

六、思考题
1、什么是梯度洗脱？它与气相色谱中的程序升温有何异同？
2、用聚酰胺粉吸附提取色素时，用柠檬酸调整样液的pH 值到6的目的是什么？如何解吸被聚酰胺粉吸附的色素？
实验七：糖精含量的检测(薄层色谱法)
一、实验目的
1. 学习薄层色谱法测定食品中糖精含量的基本原理。

2. 掌握薄层色谱法的基本操作技术。

二、实验原理
在酸性条件下，食品中的糖精钠用乙醚提取，浓缩、薄层色谱分离、显色后，与标准比较，进行定性和半定量测定。

三、仪器与试剂
1. 试剂
（1）盐酸溶液（1:1）
（2）乙醚（不含过氧化物）
（3）无水硫酸钠
（4）无水乙醇
（5）聚酰胺粉：200目
（6）展开剂：正丁醇+氨水+无水乙醇（7+1+2）
（7）显色剂：溴甲酚紫溶液0.4g/L。

称取0.04g溴甲酚紫，用乙醇（50%）溶解，加氢氧化钠溶液（4g/L）1.1mL调至pH为8，定容至100mL。

（8）糖精钠标准溶液：称取糖精钠0.1000g，用无水乙醇溶解并定容至100mL。

此液含标准精精钠为1mg/mL。

（9）可溶性淀粉
2. 仪器
（1）薄层板10×20cm；
（2）薄层层析装置；
（3）微量注射器
（4）紫外检测仪：波长254nm。

（5）玻璃喷雾器
四、实验步骤
1. 样品的提取
取 10.0mL均匀试样，置于100mL分液漏斗中，加2mL盐酸（1+1），用30、20、20mL乙醚提取三次，合并乙醚提取液，用5mL盐酸酸化的水洗涤一次，弃去水层。

乙醚层通过无水硫酸钠脱水后，挥发乙醚，加2.0mL乙醇溶解残留物，密塞保存，备用。

2. 薄层板的制备
称取1.6g聚酰胺粉，加0.4g可溶性淀粉，加约7.0mL水，研磨3-5min,立即涂成0.25-0.30mm厚的10×20cm的薄层板，室温干燥后，在80℃下干燥1h。

置于干燥器中保存。

3. 点样
点样前对薄层板进行修整，然后在薄板下端2cm 处（用铅笔轻轻画一直线为原线），用微量注射器分别点10μL和20μL的样液两个点，同时点3.0、5.0、7.0、10μL糖精钠标准溶液，各点间距1.5cm。

4. 展开与显色
将点好的薄层板放入盛有展开剂的展开槽中，展开剂液层0.5cm，展开至上端约8cm，取出薄层板，挥干，喷显色剂，斑点显黄色。

根据试样点与标准点的比移值定性。

R
f
原点至斑点中心的距离 b
R
=————————————=———
f
原点至溶剂前沿的距离 a
六、思考题
1. 样品处理时，酸化的目的是什么？
2. 点样前为什么要对薄层板进行修整？。