纤维蛋白溶解酶Ⅰ的纯化及其生物活性研究
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纤维 蛋 白溶 解 酶 Ｉ 的 纯化 及 其 生 物 活性 研 究
徐 国良 刘 忆明
（ 保 山学 院 资 源环 境学 院 ， 云南 保 山 ６ ７ ８ ０ ０ ０ ）
『 摘
要】以纤维蛋 白粗酶液为原料 ， 用硫酸铵沉淀分离 、 离子交换层析 、 凝胶过滤层析 、 凝胶 电泳分析等
方法分离纯化纤维蛋 白溶解酶 Ｉ ， 通过 Ｓ Ｄ Ｓ — Ｐ Ａ Ｇ Ｅ电泳检测纯度 ， 通过抗凝 血 、 血凝块溶解 、 溶血 、 纤维蛋 白溶解酶酶源 的激活及水解实验探讨其 生物活性 。 结果表明 ， 纯化后的纤 维蛋 白溶解酶 Ｉ 呈现单一条带 ， 该酶具有体外溶栓 、 抗凝血 、 溶解血凝块 、 激活纤溶酶原和水解纤维蛋 白原的作用 。
１ ． ４ 凝胶 电泳 分析
用超 滤膜将纤维蛋 白质粗 酶液浓 缩 １ ０ 倍，
搅拌后向浓缩后 的粗酶液中加入硫酸铵，静置
２ ４小 时 ， 在 ４℃离心 （ １ ０ ０ ０ ０× ｇ ） 分离 ， 取清 液继
续 加入硫酸铵 ， 在０ ｏ Ｃ 左右离 心分离 。 分离 出的
把４ ％的浓 缩 胶 、纤维 中蛋 白溶 解酶 液与 样品缓冲溶液混合后 ， 在沸水水浴 中加热 ３ 分
溶解 酶是 溶栓 剂今 后发 展 的一个 重要 方 向 。 日 本、 韩 国已经有 多 家公 司开 发 出 以纳豆 激酶 为 功能 成分 的保 健 品和溶 栓药 物 ， 取得 很 好 的经
济效 益闭 。 本论 文 以纤维 蛋 白粗酶 液 为原 料 ， 分 离纯
对分 子质 量为 ５ ｋ Ｄ ａ 超滤 膜进行 浓缩 、 脱盐 。
『 关 键 词】纤 维 蛋 白溶 解 酶 ； 生物活性 ； 纯化
［ 中图分类号】Ｑ ５
【 文献标识码】 Ａ
ｄ ｏ ｉ ： ｌ ０ ． ３ ９ ６ ９ ／ ］ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． １ ６ ７ ４ — ９ ３ ４ ０ ． ２ ０ １ ７ ． ０ ２ ． ０ １ ０
【 文 章 编 号 】１ ６ ７ ４ — ９ ３ ４ ０ （ ２ ０ １ ７ ） ０ ２ — ０ ２ ８ — ０ ４
１ ． ３ 凝胶 过 滤层 析
将 离子 交 换 层 析 过 的蛋 白质 酶 液 用 Ｐ Ｂ Ｓ 缓 冲液 （ ２ ０ ｍ ｍｏ ｌ ／ Ｌ ， ｐ Ｈ ７ ． ２ — ７ ． ４ ） 透 析 过夜 ， 用 超 滤膜浓缩 ， 并 离 心 分离 后 ， 加 到 凝 胶 过 滤 层 析 柱 （ 用Ｐ Ｂ Ｓ缓 冲液 （ ２ ０ ｍ ｍｏ ｌ ／ Ｌ ， ｐ Ｈ ７ ． ２ — ７ ． ４ ） 平 衡） 中， 用 Ｐ Ｂ Ｓ缓 冲液 （ ２ ０ ｍｍ ｏ ｌ ／ Ｌ ，ｐ Ｈ ７ ． ２ — ７ ． ４ ） 洗脱， 流速 为 ０ ． ５ ｍ Ｌ ／ ｍ ｉ ｎ 。 把 三份具有 活性 的纤 维蛋 白溶解 酶 溶液合 并 ， 用 截 留相对 分 子质 量 为５ ｋ Ｄ ａ 超 滤膜在 ４℃进行超 滤浓缩 、 脱盐 。 进
纤维 蛋 白溶解 酶是 丝 氨酸 蛋 白酶 的一 种 ，
有负性 调节凝血 、负性调 节 内皮 细胞增殖 和蛋
子 交换 层 析 Ｆ Ｆ柱 （ 用 ｓ — ＨＣ １ 缓 冲液 （ ５ ０ ｍｍ ｏ ｌ ／ Ｌ ， ｐ Ｈ ７ ． ５ — ８ ． ０ ） 平衡 ） 中， 用０ ． １ ｍ ｏ ｌ ／ Ｌ Ｎ ａ Ｃ Ｉ 线 性 梯度 的 Ｔ ｒ ｉ ｓ — ＨＣ Ｉ 缓 冲液 （ ５ ０ ｍｍ ｏ ｌ ／ Ｌ， ｐ Ｈ ７ ． ５ － ８ ． ０ ） 洗脱 ， 流速为 １ ２ ０ ｍＬ ／ ｈ 。 收集 三 份具 有
沉淀物用 低温 的 Ｔ ｒ ｉ ｓ — ＨＣ Ｌ缓 冲液 （ ５ ０ ｍｍ ｏ ｌ ／ Ｌ ，
ｐ Ｈ ７ ． ５ — ８ ． ０ ） 溶解 ， 充分 透析除去硫 酸铵 。
１ ． ２ 离 子 交 换 层 析
把沉淀分离后 的纤维蛋 白质酶液加到离
收 稿 日期 ： ２ ０ １ ７ — ０ ３ — ２ ６
化纤维蛋 白溶解酶 Ｉ ， 并探讨其生物活性 ， 旨在 为 开发 国 内具 有 知识 产 权 的纤 维蛋 白溶 解 酶
产品， 寻找 天然 的溶栓 药物 奠定基． １ 纤 维蛋 白质 粗酶 的沉 淀
行蛋 白质酶液离心分离 ， 把纯化 的纤维蛋 白溶 解酶溶液冷冻干燥 ， 在 ４℃条件下保存 。
ｃ Ｉ 温箱 巾进 行 温 育 ； 每 间 隔 ３小时 ， 观 察 实 验
钟后 ， 进 行 凝 胶 电泳 分 析 并分 离 ， 用 马斯 亮 蓝 Ｒ ２ ５ ０ （ ０ ． １ ％） 染色 ， 呈 现蛋 白带 后 ， 再用 甲醇 ： 乙酸 ： 水 ＝ １ ： ８ ： ８的混 合 液进 行 脱 色 ， 确 定分 离
得 到 的纤维 蛋 白溶解 酶 的纯度 。
１ ． ５ 纤维蛋 白溶 解酶 的抗 凝血 作 用
活性 的纤维蛋 白溶解 酶溶 液 ， 在 ４℃用截 留相
白水解 、 肤水解 等功能 ， 能通过 细胞表 面 的一些 受体 转导细胞 内信号 ，调节免 疫和减 轻类风 湿
关节炎 的炎症 ［ ¨ 。
我 国的心脑血管疾病发病率呈上升趋势 ， 对溶栓 药 物 的需 求 量大 ， 廉 价 的食 品纤 维蛋 白
采 取小 白鼠眼球 血样 两 份各 １ ｍＬ ，分别
作者简介 ： 徐 国良（ １ ９ ６ ９ 一） ， 男， 云南保 山人 ， 教授 ， 研究方向为无机化学应用 。
徐 国良， 刘忆明： 纤 维 蛋 白溶 解 酶 Ｉ 的 纯 化 及 其 生物 活 性 研 究
Ｊ Ｊ Ｉ ｌ 入 １ ． ４ ５ Ｕ ／ ｍｌ 和 ０ ． ２ ４ Ｕ ／ ｎ ｉ ｌ 的酶液 各 ｌ ｍｌ ； 冉 取一 绀 ＇ Ｉ ｔ ｓ ！ ｌ ！ 盐水式 样 做 比对 试验 ， 在 ３ ７
徐 国良 刘 忆明
（ 保 山学 院 资 源环 境学 院 ， 云南 保 山 ６ ７ ８ ０ ０ ０ ）
『 摘
要】以纤维蛋 白粗酶液为原料 ， 用硫酸铵沉淀分离 、 离子交换层析 、 凝胶过滤层析 、 凝胶 电泳分析等
方法分离纯化纤维蛋 白溶解酶 Ｉ ， 通过 Ｓ Ｄ Ｓ — Ｐ Ａ Ｇ Ｅ电泳检测纯度 ， 通过抗凝 血 、 血凝块溶解 、 溶血 、 纤维蛋 白溶解酶酶源 的激活及水解实验探讨其 生物活性 。 结果表明 ， 纯化后的纤 维蛋 白溶解酶 Ｉ 呈现单一条带 ， 该酶具有体外溶栓 、 抗凝血 、 溶解血凝块 、 激活纤溶酶原和水解纤维蛋 白原的作用 。
１ ． ４ 凝胶 电泳 分析
用超 滤膜将纤维蛋 白质粗 酶液浓 缩 １ ０ 倍，
搅拌后向浓缩后 的粗酶液中加入硫酸铵，静置
２ ４小 时 ， 在 ４℃离心 （ １ ０ ０ ０ ０× ｇ ） 分离 ， 取清 液继
续 加入硫酸铵 ， 在０ ｏ Ｃ 左右离 心分离 。 分离 出的
把４ ％的浓 缩 胶 、纤维 中蛋 白溶 解酶 液与 样品缓冲溶液混合后 ， 在沸水水浴 中加热 ３ 分
溶解 酶是 溶栓 剂今 后发 展 的一个 重要 方 向 。 日 本、 韩 国已经有 多 家公 司开 发 出 以纳豆 激酶 为 功能 成分 的保 健 品和溶 栓药 物 ， 取得 很 好 的经
济效 益闭 。 本论 文 以纤维 蛋 白粗酶 液 为原 料 ， 分 离纯
对分 子质 量为 ５ ｋ Ｄ ａ 超滤 膜进行 浓缩 、 脱盐 。
『 关 键 词】纤 维 蛋 白溶 解 酶 ； 生物活性 ； 纯化
［ 中图分类号】Ｑ ５
【 文献标识码】 Ａ
ｄ ｏ ｉ ： ｌ ０ ． ３ ９ ６ ９ ／ ］ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． １ ６ ７ ４ — ９ ３ ４ ０ ． ２ ０ １ ７ ． ０ ２ ． ０ １ ０
【 文 章 编 号 】１ ６ ７ ４ — ９ ３ ４ ０ （ ２ ０ １ ７ ） ０ ２ — ０ ２ ８ — ０ ４
１ ． ３ 凝胶 过 滤层 析
将 离子 交 换 层 析 过 的蛋 白质 酶 液 用 Ｐ Ｂ Ｓ 缓 冲液 （ ２ ０ ｍ ｍｏ ｌ ／ Ｌ ， ｐ Ｈ ７ ． ２ — ７ ． ４ ） 透 析 过夜 ， 用 超 滤膜浓缩 ， 并 离 心 分离 后 ， 加 到 凝 胶 过 滤 层 析 柱 （ 用Ｐ Ｂ Ｓ缓 冲液 （ ２ ０ ｍ ｍｏ ｌ ／ Ｌ ， ｐ Ｈ ７ ． ２ — ７ ． ４ ） 平 衡） 中， 用 Ｐ Ｂ Ｓ缓 冲液 （ ２ ０ ｍｍ ｏ ｌ ／ Ｌ ，ｐ Ｈ ７ ． ２ — ７ ． ４ ） 洗脱， 流速 为 ０ ． ５ ｍ Ｌ ／ ｍ ｉ ｎ 。 把 三份具有 活性 的纤 维蛋 白溶解 酶 溶液合 并 ， 用 截 留相对 分 子质 量 为５ ｋ Ｄ ａ 超 滤膜在 ４℃进行超 滤浓缩 、 脱盐 。 进
纤维 蛋 白溶解 酶是 丝 氨酸 蛋 白酶 的一 种 ，
有负性 调节凝血 、负性调 节 内皮 细胞增殖 和蛋
子 交换 层 析 Ｆ Ｆ柱 （ 用 ｓ — ＨＣ １ 缓 冲液 （ ５ ０ ｍｍ ｏ ｌ ／ Ｌ ， ｐ Ｈ ７ ． ５ — ８ ． ０ ） 平衡 ） 中， 用０ ． １ ｍ ｏ ｌ ／ Ｌ Ｎ ａ Ｃ Ｉ 线 性 梯度 的 Ｔ ｒ ｉ ｓ — ＨＣ Ｉ 缓 冲液 （ ５ ０ ｍｍ ｏ ｌ ／ Ｌ， ｐ Ｈ ７ ． ５ － ８ ． ０ ） 洗脱 ， 流速为 １ ２ ０ ｍＬ ／ ｈ 。 收集 三 份具 有
沉淀物用 低温 的 Ｔ ｒ ｉ ｓ — ＨＣ Ｌ缓 冲液 （ ５ ０ ｍｍ ｏ ｌ ／ Ｌ ，
ｐ Ｈ ７ ． ５ — ８ ． ０ ） 溶解 ， 充分 透析除去硫 酸铵 。
１ ． ２ 离 子 交 换 层 析
把沉淀分离后 的纤维蛋 白质酶液加到离
收 稿 日期 ： ２ ０ １ ７ — ０ ３ — ２ ６
化纤维蛋 白溶解酶 Ｉ ， 并探讨其生物活性 ， 旨在 为 开发 国 内具 有 知识 产 权 的纤 维蛋 白溶 解 酶
产品， 寻找 天然 的溶栓 药物 奠定基． １ 纤 维蛋 白质 粗酶 的沉 淀
行蛋 白质酶液离心分离 ， 把纯化 的纤维蛋 白溶 解酶溶液冷冻干燥 ， 在 ４℃条件下保存 。
ｃ Ｉ 温箱 巾进 行 温 育 ； 每 间 隔 ３小时 ， 观 察 实 验
钟后 ， 进 行 凝 胶 电泳 分 析 并分 离 ， 用 马斯 亮 蓝 Ｒ ２ ５ ０ （ ０ ． １ ％） 染色 ， 呈 现蛋 白带 后 ， 再用 甲醇 ： 乙酸 ： 水 ＝ １ ： ８ ： ８的混 合 液进 行 脱 色 ， 确 定分 离
得 到 的纤维 蛋 白溶解 酶 的纯度 。
１ ． ５ 纤维蛋 白溶 解酶 的抗 凝血 作 用
活性 的纤维蛋 白溶解 酶溶 液 ， 在 ４℃用截 留相
白水解 、 肤水解 等功能 ， 能通过 细胞表 面 的一些 受体 转导细胞 内信号 ，调节免 疫和减 轻类风 湿
关节炎 的炎症 ［ ¨ 。
我 国的心脑血管疾病发病率呈上升趋势 ， 对溶栓 药 物 的需 求 量大 ， 廉 价 的食 品纤 维蛋 白
采 取小 白鼠眼球 血样 两 份各 １ ｍＬ ，分别
作者简介 ： 徐 国良（ １ ９ ６ ９ 一） ， 男， 云南保 山人 ， 教授 ， 研究方向为无机化学应用 。
徐 国良， 刘忆明： 纤 维 蛋 白溶 解 酶 Ｉ 的 纯 化 及 其 生物 活 性 研 究
Ｊ Ｊ Ｉ ｌ 入 １ ． ４ ５ Ｕ ／ ｍｌ 和 ０ ． ２ ４ Ｕ ／ ｎ ｉ ｌ 的酶液 各 ｌ ｍｌ ； 冉 取一 绀 ＇ Ｉ ｔ ｓ ！ ｌ ！ 盐水式 样 做 比对 试验 ， 在 ３ ７