低温等离子体诱变选育高效脱硫菌的研究

低温等离子体诱变选育高效脱硫菌的研究
赵苗苗;李茹;李翰林;李飞洋
【摘要】采用低温等离子体对从延安黄陵某煤矿坑水中分离得到的氧化亚铁硫杆菌进行诱变育种,考察诱变时间和放电间距对诱变效果的影响,在最佳诱变条件下考察了突变菌株的脱硫性能.结果表明,原始菌株的生长周期2～3 d,Fe2+平均氧化速率为0.22 g/(L·h),通过低温等离子体诱变得到突变型菌株,在诱变时间5 min,放电间距4 mm的条件下,生长周期较原始菌株缩短12 h,Fe26+平均氧化速率提高45.5％,正突变率达24.2％,脱硫率较原始菌株提高了27.9％.
【期刊名称】《应用化工》
【年(卷),期】2016(045)002
【总页数】6页(P240-244,248)
【关键词】氧化亚铁硫杆菌;低温等离子体;最佳诱变条件;脱硫率
【作者】赵苗苗;李茹;李翰林;李飞洋
【作者单位】西安工程大学环境与化学工程学院,陕西西安710048;西安工程大学环境与化学工程学院,陕西西安710048;西安工程大学环境与化学工程学院,陕西西安710048;西安工程大学环境与化学工程学院,陕西西安710048
【正文语种】中文
【中图分类】TQ033;X172
氧化亚铁硫杆菌是一种革兰氏阴性菌,具有化能自养、好氧、嗜酸、适于中温环境等特性，随着人们对氧化亚铁硫杆菌的生活环境和生物学特征认识的不断深入,发
现其在环保领域具有重要的经济和社会意义。

氧化亚铁硫杆菌的野生菌生长周期较长,对生长条件要求苛刻,脱硫速度慢、效率低,从而限制其工业化应用。

微生物诱变育种是近年来的研究热点,吴焕利以20 W紫外灯为诱变剂,处理絮凝剂产生菌,每次取1 mL菌液,每个稀释度做3个平行,测定絮凝率发现突变菌株的絮凝率显著提高[1]。

华东理工大学张子间等[2]采用He-Ne激光诱变选育高效石油烃降解菌,结果表明,突变菌将石油烃完全降解的时间较出发菌缩短24 h。

Miura S等利用亚硝基胍诱变赖氨酸产生菌，使得赖氨酸产生量提高了2倍[3]。

目前,用于氧化亚铁硫杆菌诱变育种的方法主要有物理方法、化学方法和二者偶联的方法。

物理方法虽然操作简单，费用低廉，但正突变率低。

化学方法可操作性强，正突变率较物理方法高,但化学诱变剂大多具有毒性,不仅损害实验人员健康,还会污染环境。

并且随着这些诱变剂的反复使用,很多工业菌株已经对其产生了耐受性。

低温等离子体作为一种新型物理诱变技术,具有操作简单、突变率高的特点,在电离气体过程中产生大量活性物质,与生物体内的生物大分子发生相互作用,产生杀灭效应和其他生物学效应,能够快速突变细菌、真菌、酵母菌等微生物,获得多种突变型[4-5]。

江南大学夏书琴等[6]采用大气压辉光放电低温等离子体诱变选育茂原链轮丝菌,突变率和正突变率分别达到42.8%和20.6%,酶活较出发菌提高了82%。

安徽工程大学章宁娟等[7]采用常压室温等离子体诱变选育3-羟基丁酮菌得到高产菌株,产量较原始菌株提高了30.25%。

南京林业大学蔡聪等[8]通过等离子体诱变结芽孢杆菌，最终得到一株木糖耐受力强、L-乳酸产量高、遗传性状稳定的正向突变菌株。

此研究从延安黄陵某煤矿坑水中分离得到氧化亚铁硫杆菌,对其进行鉴定及生长特性研究,同时采用低温空气等离子体技术对筛选所得菌株进行诱变,为氧化亚铁硫杆菌开发及应用奠定基础。

硫酸亚铁、硫酸铵、氯化钾、硫酸镁、磷酸氢二钾、硝酸钙、琼脂、重铬酸钾、硫
代硫酸钠、碘化钾均为分析纯。

电晕放电装置,自制；BZ-200B2恒温振荡箱；LR-PH-S25精密pH计；TU-1901紫外可见分光光度计；HVE-50高压灭菌锅；ST60光学显微镜。

致死率
正突变率
Fe2+氧化速率
将原始菌株与诱变菌株在相同条件下培养,取270 mL 9K液体培养基于500 mL锥形瓶中,按体积分数10%接种,温度30 ℃,转速150 r/min的条件下振荡培养,用气体采样器采集30 mL SO2气体,通入液体培养基中,测得的初始浓度,培养过程中测定浓度,增加量即为的减小量,的减小量与最初的含量之比为脱硫率。

采用革兰氏染色法观察菌株单细胞形态，结果见图1。

由图1可知，原始菌种革兰氏染色为红色,为革兰氏阴性菌,呈短杆状,一个或多个聚集成短杆状排列,大小约0.4 μm×1.1 μm,在平板上的菌落为白色小圆点,直径约1 mm凸起,边缘整齐,与氧化亚铁硫杆菌菌落典型特征相符。

氧化亚铁硫杆菌的生长曲线,见图2。

由图2可知，氧化亚铁硫杆菌的生长周期约2～3 d。

在培养初期，细菌生长缓慢,这是氧化亚铁硫杆菌进入新环境后的适应阶段,此时细菌菌体增大,代谢活跃；培养20 h后，细菌进入对数期(又称指数期),细菌生长迅速,活菌数以恒定的几何级数增长；稳定期内由于培养基中营养物质消耗,有害代谢产物积聚,因此细菌繁殖速度减缓,死亡数目逐渐增加；40 h后DO值有降低趋势，即细菌浓度开始减少,细菌生长进入衰亡期。

氧化亚铁硫杆菌通过氧化亚铁离子为铁离子而获得能量,铁离子发生水解反应，生成黄钾铁矾沉淀,在氧化亚铁硫杆菌的生长过程中,Fe2+不断被氧化而逐渐减
少,Fe2+浓度曲线可在一定意义上反应出菌种活性。

氧化亚铁硫杆菌Fe2+浓度测
定结果见图2。

由图2可知，Fe2+初始浓度8.9 g/L,0～18 h内Fe2+浓度有降低趋势,但是减小速度非常缓慢；18～30 h,Fe2+浓度从8.6 g/L迅速下降至0.46 g/L；对数期结束时,Fe2+基本被氧化,氧化率达到94.65%。

这是因为在培养初期,细菌生长缓慢，进入对数期生长,细菌生长迅速,需要消耗大量的Fe2+,稳定期细菌繁殖速度非常缓慢,衰亡期细菌数目开始减少,仅消耗少量的Fe2+。

由图3可知,在同一放电间距下,诱变时间在1～3 min,致死率逐渐增大,随着诱变时间继续增加,致死率呈现减小趋势,诱变处理5 min时,致死率达到极小值,随后致死率开始增大,诱变时间与菌株致死率的关系总体呈现马鞍型曲线。

这可能是因为等离子体起初是一种表面反应过程,空气击穿产生的多种带电粒子或活性基团直接作用于细胞膜[19],引起细胞表面损伤,同时破坏胞内蛋白及核酸等物质,导致致死率上升,随后致死率下降是由于低温等离子体引起了氧化亚铁硫杆菌内DNA修复酶等修复系统的启动,快速修复亚致死损伤。

致死率二次出现增长趋势,是由于氧化亚铁硫杆菌体内损伤过于严重,修复机制不足以修复这些损伤。

低温空气等离子体对氧化亚铁硫杆菌致死作用的波动性,使得菌体在较长的处理时间下表现出明显的诱变效应。

保持诱变时间不变,随着放电间距增大,氧化亚铁硫杆菌的致死率减小,这可能是因为,低温等离子体在电离气体过程中生成活性自由基,一般自由基化学性能不稳定,存在时间极短,放电间距过大会延长活性自由基到达菌液表面的时间，从而降低了菌液表面单位面积上活性自由基浓度,当放电间距设定为1 mm时,菌液表面活性自由基浓度最高,随着放电间距增大,活性自由基浓度降低,致死率相应减小。

依次挑取不同诱变时间和放电间距下的单菌落，进行振荡培养,随机挑取，进行摇瓶复筛,并统计突变率,结果见图4。

由图4可知,在同一放电间距下,诱变处理1～3 min时,由于等离子体作用时间太短,不足以激活修复机制,因此产生正突变体的机率很小。

诱变处理8 min和9 min时,
致死率过高，可用于筛选的菌种过少,亦不适用于菌株正突变；诱变处理5 min时,突变率达到最大值。

当放电间距为1，2 mm时,导致大量细菌死亡,尽管近距离诱
变处理对细菌能产生较大作用,但从突变率曲线上可以看出,近距离诱变处理并不能
获得理想突变率。

当放电间距设定为6 mm和7 mm时,即便长时间照射,细菌致死率仍然较低,这表明远距离诱变处理对细菌影响较小。

因此就突变率而言,过短或过
长的诱变时间,太近或太远的放电间距,都不适用于氧化亚铁硫杆菌的等离子体诱变
作用。

在5 min,4 mm的诱变条件下,氧化亚铁硫杆菌的突变率最高，可达24.2%,最终确定其为最佳诱变条件。

由图5可知，有4株突变菌株氧化率较原始菌株提高10%以上。

将突变菌株连续
9代培养,每隔4 h测定菌液浓度、pH值、电导率、Fe2+浓度,结果表明，各代间
几乎无差别,Fe2+的氧化率无明显波动,具有良好的遗传稳定性,可用于后续脱硫实验。

将原始菌株与诱变菌株在相同条件下培养,每隔6 h测定细胞浓度、Fe2+浓度以及胞外聚合物的含量,结果见图6和图7。

由图6可知,在培养初期诱变菌株与原始菌株菌体量无明显差异,稳定期，菌体量与出发菌几乎相同；诱变菌，株菌体量在振荡培养8 h后,从缓慢增长阶段进入指数
增长阶段,而原始菌株20 h后迅速增长进入对数期,氧化亚铁硫杆菌的生长周期缩
短了12 h,诱变菌株Fe2+平均氧化速率为0.32 g/(L·h),较原始菌株提高了45.5%。

由图7可知,原始菌株在振荡培养30 h后,胞外聚合物合成量达到最大值642.2
μg/1010个细胞,诱变菌株在振荡培养18 h后，胞外聚合物合成量达到最大值955.7 μg/1010个细胞,比出发菌增加了49%。

这说明,低温空气等离子体诱变,提
高了胞外聚合物合成酶的活性,促进菌株与能源的接触,创造自身微环境,增加亚铁和Fe3+浓度,从而加快细菌的生长速率。

将原始菌株与诱变菌株在相同条件下培养,的初始浓度为4 460 mg/L,每隔6 h测
定培养基中浓度。

原始菌株与突变菌株脱硫性能见图8。

由图8可知，在振荡培养50 h后,诱变菌株与原始菌株脱硫率基本保持不变,原始菌株脱硫率为77.27%,诱变菌株脱硫率为98.81%,较原始菌株提高了27.9%。

(1)采用革兰氏染色法对单细胞形态进行观察,判定其为革兰氏阴性菌。

生长周期2～3 d。

培养初期，菌体浓度缓慢增长,相应Fe2+浓度降低幅度不明显；振荡培养20 h后,菌体浓度呈指数形式增加,Fe2+浓度迅速降低;30 h左右，Fe2+基本被氧化,氧化率达到94.65%。

(2)采用低温空气等离子体诱变处理原始菌株,改变诱变时间,致死率先增大后减小,取得一个极小值后开始增大,最终趋于稳定值。

改变放电间距,致死率呈现缓慢减小趋势。

依次挑取不同处理时间和放电间距下的菌落进行振荡培养,并统计突变率,当处理时间为5 min,放电间距为4 mm时,突变率达到最大值为24.2%,从而确定其为最佳诱变条件。

(3)经过反复诱变、筛选，得到产量提高幅度较大的突变菌株,对其进行多代连续培养,得到遗传性状稳定的突变菌株。

对原始菌株与诱变菌株振荡培养过程进行动态比较分析,诱变菌株生长周期缩短12 h,Fe2+平均氧化速率提高了45.5%,胞外聚合物合成量较原始菌株增加49%。

这说明低温空气等离子体用于氧化亚铁硫杆菌的诱变育种切实可行。

(4)对原始菌株与诱变菌株的脱硫性能进行测定,得到原始菌株的脱硫率为77.27%,诱变菌株的脱硫率为98.81%,较原始菌株提高了27.9%。