水貂阿留申病毒纳米PCR检测方法的建立与初步应用

期 11
杨 瑞 梅 等 ：水 貂 阿 留 申 病 毒 纳 米 PCR 检 测 方 法 的 建 立 与s.ThelowerdetectionlimitofthenanoPCRassaywasabout4.0×102copies.Furthermore，atotal of40clinicalsamplesweredetectedbythisassay.TheresultsshowedthatthenanoPCRissensitivethan counterimmunoelectrophoresis （CIEP）.ThenanoPCRassaydevelopedinthisstudycanbeapplied widelyinclinicaldiagnosistheurineandfecesandfieldsurveillanceofAMDV-infection. Keywords：Aleutian minkdiseasevirus；nanoparticlePCR；molecularassay
畜牧兽医学报 2016，47（11）：2288-2293
ActaVeterinariaetZootechnicaSinica
doi：10.11843/j.issn.0366-6964.2016.11.017
水貂阿留的申建病立毒与纳初米步PC应R用检测方法
杨瑞梅，张传美，张洪亮，单 虎*
（青岛农业大学动物科技学院，山东省预防兽医重点实验室，青岛 266109）
TheEstablishmentandApplicationofNanoparticlePCR Molecular AssayforDetectionofAleutian MinkDiseaseVirus
YANGRui-mei，ZHANGChuan-mei，ZHANG Hong-liang，SHAN Hu* （KeyLaboratoryofPreventiveVeterinary MedicineofShandongProvince，CollegeofAnimal
特异性和灵敏度进行了评估。结果表明，此纳米 PCR的最佳退火温度为51 ℃，普通 PCR 为55 ℃；加入胶体金最
佳浓度在0.2～0.8nmol·L-1，纳米 PCR 与普通 PCR 产物测序相似性大于99%。特异性检测表明该纳米 PCR
方法只扩增 AMDV 而不能扩增犬瘟热病毒和水貂肠炎细小病毒。在粪尿样品检测中该纳米 PCR 敏感性比普通
SciencesandTechnology ，QingdaoAgriculturalUniversity，Qingdao266109，China）
Abstract：Nanoparticle-assistedpolymerasechainreaction （nanoPCR）isanovelmethodforthe rapidamplificationofDNA.Thisstudy wasaimedtoestablishasimpleandsensitivenanoPCR assayfordetectionofAleutianminkdiseasevirus（AMDV），primersweredesignedbasedonthe conservedregionoftheNS1genesequencesavailableinGenBanktoamplifya365bpfragment. Theoptimizedannealingtemperatureandtheconcentrationofgoldnanoparticles werestudied. WhetherornottheDNAreplicationfidelitycompromisedinnanoparticla-assistedPCR wasdetectedbysequencingnanoPCR products.A nanoPCRassay wasdevelopedanditssensitivityand specificitywereinvestigated.UndertheoptimizedconditionsofnanoPCRassay，annealingtemperaturewas51℃ butthatofconventionalPCRwas55 ℃.Thebestconcentrationofgoldnanoparticleswasintherangeof0.2-0.8nmol·L-1.The99% homologybetweentheproductsobtainedwiththenanoPCR amplificationandtheconventionalPCRshowedthathighlylevelsof DNAreplicationfidelityinthisnanoPCR.Inaddition，theother minkvirusesdetectedbythe nanoPCR wereallnegative.UndertheoptimizedconditionsoftheAMDV nanoPCRassay，the nanoPCRassay was10-fold moresensitivethanaconventionalPCRassayinurineandfecessam-
摘 要：为建立便捷、灵敏的水貂阿留申病病毒 纳 （AMDV） 米 PCR 检测方法，根据 AMDV NS1基因的保守序列
设计 一 对 特 异 性 引 物 ，对 纳 米 PCR 反 应 的 退 火 温 度 、胶 体 金 浓 度 进 行 了 优 化 ；测 序 检 测 扩 增 基 因 是 否 发 生 变 异 ；对
PCR高 倍 10 。检测40份临床样品，结果表明该方法比对流免疫电泳检测敏感性提高，从而为用粪、尿等低病毒样
品检测水貂阿留申病提供了一种新的有效方法。
关键词：水貂阿留申病病毒；纳米 检 PCR； 测
中 图 分 类 号 ：S852.659.2
文献标志码：A
文 章 编 号 ：0366-6964（2016）11-2288-06
收 稿 日 期 ：2016-07-01 基金项目：科技部科技基础性工作专项 山 （2012FY111000）； 东省自主创新及成果转化专项（2014ZZCX07105） 作者简介：杨瑞梅 女 （1975-）， ，陕西长安人，副教授，博士，主要从事毛皮动物疫病研究，E-mail：@ *通信作者：单 虎，教授，博士，主要从事动物传染病研究，E-mail：shanhu@