猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株RT-PCR快速鉴别检测方法的建立

猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株RT-PCR快速鉴别检测方
法的建立
郭抗抗;邓力;井勇;张彦明;王晶钰;宁蓬勃
【摘要】[目的]建立猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株的RT-PCR快速鉴别检测方法.[方法]根据Gen-Bank中36株猪瘟病毒(CSFV)强毒株和兔化弱毒疫苗株的基因序列,分别设计了针对CSFV强毒和兔化弱毒疫苗株的特异性引物,建立了一种能区分CSFV强毒和兔化弱毒疫苗株的RT-PCR检测方法.[结果]建立的RT-PCR检测方法可以从CSFV强毒株和兔化弱毒疫苗株中分别扩增出大小为187和492 bp 的特异性片段,对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等猪源性病毒的检测结果均为阴性,说明该方法具有较好的特异性.对10份疑似猪瘟临床样品进行检测后发现,利用该方法可以从中分别检测出CSFV强毒和疫苗毒.[结论]建立了可鉴别检测CSFV强毒株和弱毒疫苗株的RT-PCR方法,为猪瘟的早期诊断及疫苗免疫猪和野毒感染猪的鉴别提供了技术参考.
【期刊名称】《西北农林科技大学学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2010(038)006
【总页数】6页(P13-18)
【关键词】猪瘟病毒;猪瘟兔化弱毒疫苗;反转录-聚合酶链式反应;鉴别检测
【作者】郭抗抗;邓力;井勇;张彦明;王晶钰;宁蓬勃
【作者单位】西北农林科技大学,动物医学院,陕西,杨凌,712100;西北农林科技大学,动物医学院,陕西,杨凌,712100;西北农林科技大学,动物医学院,陕西,杨凌,712100;
西北农林科技大学,动物医学院,陕西,杨凌,712100;西北农林科技大学,动物医学院,
陕西,杨凌,712100;西北农林科技大学,动物医学院,陕西,杨凌,712100
【正文语种】中文
【中图分类】S852.65+1
猪瘟(Classical swine fever，CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的一种以患猪稽留高热、出血和高死亡率为主要特征的接触性和高度致死性疾病，被世界动物卫生组织(OIE)列为必须报告的动物疫病。

CSFV为黄病毒
科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)成员[1]，基因组为单股正链RNA，呈球形，有囊膜，二十面体对称，核衣壳被脂质层包围，基因组长约为12.3 kb，仅包含有一个大的开放阅读框(Open reading frame,ORF)。

在猪瘟的防控方面，欧盟各国从20世纪90年代开始，采取对猪瘟患猪和猪瘟病
毒感染猪进行宰杀的方式来达到对猪瘟净化的目的[2]；中国则采取以疫苗免疫接
种为主的方法，猪瘟弱毒疫苗是目前生产中使用的主要疫苗，使用最广泛的是猪瘟兔化弱毒疫苗(HCLV株)，其免疫保护作用确实，在猪瘟的防控上起到了重要作用。

用弱毒疫苗免疫猪虽然可以产生完全的免疫保护，但也存在无法从血清学上区分CSFV自然感染猪和疫苗免疫猪的问题，给CSFV感染猪和疫苗免疫猪的鉴别诊断带来了很大困难。

近年来研制的新型猪瘟疫苗，在防止弱毒疫苗毒力返强方面有其优势，但也存在临床应用的问题，如各种猪瘟亚单位疫苗免疫效率低、不能提供完全的免疫保护等，且不能满足CSFV感染时的紧急免疫需要[3]。

尤其是20世纪
70年代后期，国内猪瘟的流行和发病特点发生了很大变化，临床表现趋于复杂化，
出现了所谓“非典型猪瘟”、“温和型猪瘟”和“带毒母猪综合征”，而典型性病例减少，这给疾病的诊断带来困难[4-5]。

由于发达国家对猪瘟采取扑杀而非免疫
政策，对猪瘟的诊断还是以血清学为主，因此某些注射了猪瘟弱毒疫苗的出口猪群有可能全部被扑杀掉。

因此，亟待建立一种可以准确鉴别诊断CSFV野毒感染猪和疫苗免疫猪的敏感而特异的方法。

随着对不同来源、不同地区CSFV野毒株和疫苗毒株全基因序列测序的完成，加之分子生物学检测技术的逐步完善，使得从分子水平上建立CSFV强毒和疫苗毒鉴别检测的新方法成为可能。

国内外在CSFV强、弱毒鉴别方法方面进行了大量研究，建立了一些有效的方法和技术。

李艳等[6]建立了一种能区分CSFV强毒和弱毒的
反转录-套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)检测方法，但套式RT-PCR操作相对繁琐，耗时较长。

赵建军等[7]建立了CSFV野毒株和兔化弱毒疫苗株复合实时荧光定量RT-PCR鉴别方法，也可用于CSFV强毒和兔化弱毒疫苗的定量和鉴别，是一种较好的方法，但该方法需要荧光定量PCR仪，因而该技术在一般实验室不易开展，
使其应用受到限制。

Immanuel 等[8]也建立了可以鉴别检测CSFV C株疫苗毒株
和野毒株的实时荧光定量RT-PCR方法，并在疫苗免疫猪和野毒感染猪的鉴别诊
断中得到应用。

PCR方法最突出的优点是快速、敏感、产物可直接用于序列测定，可依据特定的
基因序列对待检毒株进行分型。

套式RT-PCR和荧光定量RT-PCR是比较敏感的
基因检测方法，但存在操作比较费时和需要昂贵仪器的不足，难以在一般实验室和基层检验室开展应用。

为此，本研究在分析国内外提交的CSFV(野毒株、猪瘟兔化弱毒疫苗株、Shimen 株、Alfort株、Brescia株)全基因序列的基础上，比较了CSFV强毒株和弱毒株存在基因差异的区域，并设计特异性引物，建立了可鉴别区分CSFV强毒和弱毒的RT-PCR方法，以期为猪瘟的早期诊断及疫苗免疫猪和野毒感染猪的鉴别提供技术
参考。

1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病毒和阳性质粒猪瘟兔化弱毒疫苗株(C株)、猪瘟病毒强毒株(Shimen株)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)，均由西北农林科技大学动物医学院预防兽医实验室保存并提供。

含猪瘟兔化弱毒疫苗株(C株)全长基因片段的质粒(pcDNA3.1-C)，由西北农林科
技大学动物医学院张淼涛副教授惠赠。

含猪瘟病毒强毒株(Shimen株)相应目的基
因片段的质粒(pcDNA3.1-S)，由西北农林科技大学动物医学院预防兽医实验室构
建并提供。

1.1.2 引物设计与合成参照GenBank收录的36株CSFV(包括HCLV株、Shimen株、Brescia株、Alfort株)基因组序列，通过MegAlign软件对其序列进行比较，在高度保守和强、弱毒有明显差异的区段设计引物。

检测CSFV强毒(参考株:AF092448)的引物序列为：CSFV-S-F(5′-ATCAGTCTCTGGAATTGTTGGCA-3′)和CSFV-S-R(5′-CAAGCACGGATGAGGAATGCCG-3′)，预期扩增产物长度187 bp。

检测CSFV弱毒(参考株:AF091507)的引物序列为：CSFV-C-F(5′-ACACACACGACAAGGTGGCATC-3′)和CSFV-C-R(5′-TGAATTCTGTCCCCTGCTTCATG-3′)，预期扩增产物长度492 bp。

引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，使用浓度为10 μmol/L。

1.1.3 病料收集陕西杨凌农户散养疑似猪瘟患猪的组织病料(淋巴结、脾脏)10份，于-70 ℃保存备用。

1.1.4 主要试剂 TRIzol Reagent，购自Invitrogen公司；禽源反转录酶AMV、RNA酶抑制剂、Taq DNA聚合酶、dNTPs、 DNA Marker DL2000等，均购自
大连TaKaRa 公司。

其余试剂均为国产或进口分析纯。

1.2 病毒RNA的提取和cDNA的合成
按照TRIzol试剂RNA提取使用说明，分别从CSFV 强毒细胞培养物、CSFV 疫苗弱毒细胞培养物和采集的病料中提取病毒基因组RNA，加入30 μL DEPC处理水和1 μL RNA酶抑制剂立即进行反转录或置于-20 ℃保存备用。

按照下列程序进行反转录合成cDNA：病毒RNA 11 μL，CSFV-S-R/CSFV-C-R 1 μL，70 ℃孵育5 min，冰浴5 min；再加(5×)AMV Buffer 4 μL，Ribonuclease inhibitor 1 μL，dNTPs(10 mmol/L) 2 μL，7 ℃孵育5 min后加AMV酶1 μL，体积达到20 μL；42 ℃ 60 min，70 ℃ 10 min 终止反应，置冰上备用。

1.3 CSFV阳性质粒及其细胞培养物的PCR检测
1.3.1 阳性质粒的PCR检测分别以CSFV Shimen株阳性质粒(CSFV-S)和CSFV C 株全长质粒(CSFV-C)为模板，用设计的CSFV 强、弱毒引物进行PCR扩增。

PCR 反应体系(25 μL)为：质粒DNA模板0.5 μL，Taq DNA聚合酶10×buffer(含Mg2+)
2.5 μL，dNTPs (10 mmol/L)2 μL，上、下游引物(10 μmol/L) 各1 μL，Taq DNA聚合酶(5 U/μL) 0.5 μL，用灭菌纯水补至25 μL。

PCR扩增程序为：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min，置于4 ℃保存。

取PCR产物10 μL于10 g/L琼脂糖凝胶上电泳检测。

1.3.2 细胞培养物的PCR检测及条件优化分别以反转录的CSFV强毒和弱毒cDNA为模板，进行PCR扩增。

对引物、dNTPs和Taq DNA聚合酶的最佳浓度进行筛选,并对反应程序进行优化。

最终确定CSFV细胞、组织毒检测最佳体系为25 μL：包括cDNA
2.5 μL，Taq DNA聚合酶10×buffer(含Mg2+)2.5 μL，dNTPs (10 mmol/L)2 μL，上、下游引物(10 μmol/L) 各0.5 μL，Taq DNA聚合酶(5 U/μL) 0.5 μL，用灭菌纯水补至25 μL。

PCR扩增程序为：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。

1.4 引物的特异性试验与PCR产物鉴定
分别以设计的CSFV强、弱毒引物扩增CSFV强毒、CSFV弱毒、PRRSV、PCV2、TGEV和正常细胞(对照)，验证引物的特异性。

RT-PCR条件同1.3.2。

将CSFV强毒和弱毒特异性PCR产物经胶回收纯化后，送北京六合华大基因科技有限公司进
行序列测定。

1.5 临床样品的检测
用建立的RT-PCR方法检测10份疑似CSF的患猪病料，对CSFV强、弱毒进行鉴别检测。

2 结果与分析
2.1 RT-PCR扩增CSFV反应条件的确定
分别用设计的CSFV强毒特异性引物(CSFV-S-F/CSFV-S-R)和CSFV 弱毒特异性
引物(CSFV-C-F/CSFV-C-R)，在不同退火温度下扩增CSFV Shimen株阳性质粒(CSFV-S)、CSFV C株全长质粒(CSFV-C)及猪瘟兔化弱毒疫苗株(C株)、CSFV强
毒株(Shimen株)的cDNA，发现退火温度在52～55 ℃时，弱毒引物从弱毒模板，或强毒引物从强毒模板中均可扩增出1条特异的目的条带，其中在53 ℃扩增时，目的条带均最亮，故选用53 ℃作为本试验扩增的退火温度。

2.2 RT-PCR对CSFV强、弱毒株的扩增
2.2.1 CSFV强毒株的扩增分别用CSFV强毒特异性引物(CSFV-S-F/CSFV-S-R)和CSFV 弱毒特异性引物(CSFV-C-F/CSFV-C-R)，对CSFV Shimen株阳性质粒(CSFV-S)和CSFV强毒株(Shimen株)cDNA进行扩增，扩增产物在 10 g/L琼脂
糖凝胶上电泳检，结果见图1。

图1结果显示，CSFV强毒引物及其强毒模板反应管中的PCR产物，经电泳后均可得到1条约187 bp的特异性条带，而CSFV弱
毒引物及其强毒模板反应管中均没有条带出现。

图 1 CSFV强毒的PCR扩增结果M.DNA Marker DL2000；1.CSFV强毒引物
+CSFV-S质粒；2.CSFV强毒引物+CSFV 强毒cDNA；3.强毒阴性对照；4.CSFV 弱毒引物+CSFV-S质粒；5.CSFV弱毒引物+CSFV强毒cDNAFig.1 PCR results of CSFV wild-typeM.DNA Marker DL2000;1.Primer of CSFV wild-
type+CSFV-S plasmid;2.Primer of CSFV wild-type+CSFV Shimen strain cDNA;3.Negative control;4.Primer of CSFV C+CSFV-S plasmid;5.Primer of CSFV C+CSFV Shimen-strain cDNA图 2 CSFV弱毒的PCR扩增结果M.DNA Marker DL2000；1.阴性对照；2.CSFV弱毒引物+CSFV-C质粒；3.CSFV弱毒引物+CSFV弱毒cDNA；4.CSFV强毒引物+CSFV-C质粒；5.CSFV强毒引物
+CSFV弱毒cDNAFig.2 PCR results of CSFV C-strain vaccineM.DNA Marker DL2000；1.Negative control；2.Primer of CSFV vaccine+CSFV-C plasmid;
3.Primer of CSFV vaccine+CSFV C-strain cDNA;
4.Primer of CSFV wild-type+CSFV-C plasmid;
5.Primer of CSFV wild-type+CSFV C-strain cDNA 2.2.2 CSFV弱毒株的扩增分别用CSFV强毒特异性引物(CSFV-S-F/CSFV-S-R)和CSFV 弱毒特异性引物(CSFV-C-F/CSFV-C-R)，对CSFV C株全长质粒(CSFV-C)和CSFV弱毒株(C株)cDNA进行扩增，扩增产物在 10 g/L琼脂糖凝胶上电泳检测，结果见图2。

图2结果显示，CSFV弱毒引物及其弱毒模板反应管中的PCR 产物，经电泳后均能得到1条约492 bp的特异性条带，而CSFV强毒引物及其弱毒模板反应管中没有条带出现。

2.2.3 CSFV强毒和弱毒株混合后的扩增将CSFV强毒和弱毒细胞培养物混合后提取总RNA，进行反转录得到cDNA。

分别用CSFV强毒引物和弱毒引物对CSFV 强、弱毒混合的cDNA进行PCR扩增，扩增产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳，结果见图3。

图3结果显示，用CSFV强毒引物可扩增到惟一的1条特异性条带，
大小约为187 bp；用CSFV弱毒引物可扩增到1条大小约为492 bp的特异性条带。

2.3 PCR产物的鉴定
PCR 产物测序表明，CSFV Shimen株的PCR产物长度为187 bp，CSFV C株的PCR 产物长度为492 bp，产物序列与模板cDNA 片段序列一致。

测序结果略。

图 3 CSFV强毒和弱毒混合后的PCR扩增结果
M.DNA Marker DL2000；1.CSFV强毒引物+强弱毒cDNA；2.CSFV弱毒引物+强弱毒cDNA；3.强毒引物阴性对照；4.弱毒引物阴性对照
Fig.3 PCR results of CSFV wild-type and C-strain vaccine
M.DNA Marker DL2000;1.Primer of CSFV wild-type+cDNA of CSFV Shimen and C-strain;2.Primer of CSFV vaccine+cDNA of CSFV Shimen and C-strain;
3.Negative control of CSFV wild-type primer;
4.Negative control of CSFV C-strain vaccine primer
2.4 对其他猪源病毒和疑似猪瘟病料的检测
采用建立的RT-PCR方法，分别用CSFV强毒引物、弱毒引物、CSFV强毒引物+
弱毒引物，对实验室保存的PRRSV、PCV2和TGEV等的感染细胞进行电泳检测，结果均未出现任何扩增条带。

分别用CSFV强毒引物、弱毒引物、CSFV强毒引物+弱毒引物，对临床采集的10份疑似猪瘟病料进行检测，图4A和4B的检测结果显示，其中2份类似于CSFV强毒，7份类似于疫苗毒，1份无CSFV检出。

图 4 猪瘟疑似病料的检测M.DNA Marker DL2000；N.阴性对照；1～10.疑似猪瘟病料Fig.4 Detection of CSFV in clinical samples suspected CSFM.DNA Marker DL2000；N.Negative control;1-10.Samples from pigs suspected of CSF
3 讨论
猪瘟病毒的检测方法主要有病毒分离、荧光抗体法、动物接种、间接血凝试验、血清中和试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)和反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)等。

病毒分离和动物接种法存在检测周期长、操作步骤繁琐、检测率低等不足；抗原抗体反应检测方法则有敏感度不高、不能对早期感染猪进行准确诊断的局限。

随着CSFV分子生物学研究的深入，及CSFV不同分离毒株和疫苗株基因全序列的陆续发表，对CSFV的检测和CSF诊断也进入了分子水平，PCR技术及其衍生的相关技术被越来越多地用于CSFV的检测。

吴鑫等[9]建立了CSFV一步法RT-PCR检测方法，以CSFV Shimen株E2基因为检测对象，但CSFV强毒和疫苗毒在该区段的差异性有限，存在检测猪瘟疫苗免疫猪时出现假阳性的可能。

殷进方等[10]通过建立的实时荧光定量RT-PCR法检测CSFV，结合直接免疫荧光抗体试验同时对临床样品进行检测，证明两者检测结果一致。

桂祎等[11]通过比较RT-PCR和ELISA对疑似CSF病料的检测效果，发现RT-PCR的检测率低于ELISA法，这可能与引物的设计有关。

在CSFV鉴别检测方面的研究资料较少，主要是应用套式RT-PCR 和实时荧光定量RT-PCR来鉴别检测CSFV强毒与疫苗毒，也有用多重RT-PCR检测CSFV和其他瘟病毒的报道。

李艳等[6]、鲁建民等[12]分别建立了鉴别CSFV强、弱毒的套式RT-PCR方法。

赵建军等[7]、Immanuel等[8]、Huang 等[13]分别建立了鉴别检测CSFV强毒株和弱毒疫苗株的实时RT-PCR方法，具有较高的敏感性和特异性，但也存在检测成本高的不足，限制了其在大规模流行病学调查中的应用。

Heidy等[14]建立的多重RT-PCR方法可用于区分CSFV 和其他瘟病毒，也可在CSFV检测中避免其他瘟病毒的干扰。

本研究通过对36株CSFV强毒株和弱毒株基因全序列的分析，寻找强、弱毒株基因差异片段并设计引物；通过对CSFV强毒株和疫苗弱毒株阳性质粒的检测证明，
设计的引物具有较好的特异性，且无交叉反应，可用于CSFV强毒株和疫苗弱毒株的鉴别检测；通过对反应体系和条件的优化，建立了可鉴别检测CSFV强毒株和弱毒株的RT-PCR方法。

在CSFV Shimen株中得到187 bp的特异性扩增产物，在C株中扩增出了492 bp的特异性产物，测序结果表明产物来自相应的病毒模板。

对PRRSV、TGEV和PCV2等常见猪源病毒细胞培养物进行检测，并未扩增到任何条带，说明建立的方法具有较好的特异性。

对来自临床疑似CSF的组织病料进行检测，结果显示有2份疑似CSFV强毒，7份疑似疫苗弱毒，提示在猪瘟强制免疫下，可能会存在漏免或免疫失败的现象，继而引发野毒的感染，对此应引起足够的重视。

本研究分别用CSFV强、弱毒引物对CSFV Shimen 毒株和CSFV C株的细胞混合培养物进行检测，证明分别用设计的引物可以从混合的强、弱毒中扩增得到相应的产物。

但将引物混合后(即同时加上强毒和弱毒引物)再检测混合的强弱毒细胞培养物时，结果并不是很稳定，个中原因尚需进一步分析。

本研究建立的鉴别检测CSFV强、弱毒株的RT-PCR方法，在经过反转录后只需1次PCR反应就可对样品中的CSFV强、弱毒株进行鉴别检测，适于一般实验室开展此项工作，对猪瘟的净化和防控有一定的参考价值。

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