发酵工程基本操作[可修改版ppt]
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• 半固体制曲和酵母生产中无菌要求不十分严格，一 般无需复杂的空所净化处理；
• 密闭的深层通气发酵需严格的纯净培养，进入发酵 罐前空气必须进行冷却、脱水、脱油和过滤除菌等 处理。
（二）发酵对空气无菌程度
的要求
• 好气性发酵过程中需要大量的无菌空气，空气要 作到 绝对无菌在目前是不可能的，也是不经济 的。
• 表面消毒剂是指对一切活细胞都有毒性，不能 用作活细胞内的化学治疗用的化学药剂。
• 为比较各种表面消毒剂的相对杀菌强度，常采 用在临床上最早使用的消毒剂——石炭酸作为 比较的标准，并提出了石炭酸系数这一指标。
• 所谓石炭酸系数，指在一定时间内被试药剂能 杀死全部供试菌的最高稀释度与达到同效的石 炭酸的最高稀释度的比率。一般规定处理时间 为10分钟，而供试菌定为Salmonellatyphi（伤 寒沙门氏菌）。
二、灭菌的实际操作
• （一）空罐灭菌 • 空罐灭菌也称空消。无论是种子罐、发酵罐、
还是尿素（或液氨）罐、消泡罐，当培养基 （或物料）尚未进罐前对罐进行预先灭菌，为 空罐灭菌。 • 为了杀死所有微生物特别是耐热的的芽孢，空 罐灭菌要求温度较高，灭菌时间较长，只有这 样才能杀死设备中各死角残存的杂菌或芽孢。
• 空气中的微生物种类以细菌和细菌芽胞较多， 也有酵母，霉菌和病毒。
• 这些微生物大小不一，ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ般附着在空气中的灰 尘上或雾滴上，空气中微生物的含量一般为 103~104个／米3。
• 灰尘粒子的平均大小约0.6μm左右，所以空气 除菌主要是去除空气中的微粒(0.6-1μm ）
二、空气除菌
• 工业发酵对空气处理的要求随发酵产品和菌种不同 而异。
• 最后，还可以用气体灭菌剂如氧化乙烯 等对个别成分进行灭菌处理。
三、化学杀菌剂或制菌剂
（一）表面消毒剂
• 常用消毒剂的种类很多，它们的杀菌强度 各不相同。但几乎都有一个共同规律，即当其 在极低浓度时，常常会对微生物的生命活动起 刺激作用，随着浓度逐渐增高，就相继出现制 菌和杀菌作用，因而形成一个连续的作用谱。
发酵工程基本操作
第一节 严格消毒灭菌
• 控制有害微生物主要有以下几种措施
除菌的方法
• 培养基的加热灭菌（包括常压或蒸汽高 压加热法）
• 空气的过滤除菌 • 紫外线或电离辐射 • 化学药物灭菌
培养基的灭菌
一、影响培养基灭菌的因素
• 1、pH值的影响 • pH值对微生物的耐热性影响很
大 ， pH 为 6.0-8.0 时 微 生 物 最 不易死亡， pH <6.0时氢离子 易渗入微生物的细胞内。
第二节 空气的净化
一、空气中微生物的分布
• 空气中微生物的含量和种类，随地区，季节和 空气中灰尘粒子多少，以及人们的活动情况而 异。
• .北方气候干燥，寒冷，空气中的含菌量较多， 离地面越高，含菌量越少；一般每升高10米， 空气中的含菌量就降低一个数量级；
• 城市的空气中含菌量较多，农村的空气中含菌 量较少，一般城市空气中杂菌数为3000~8000 个／米3 。
消毒试验
• ⑴ 以人工染菌实物为消毒对象，模拟现场表面 污染大肠杆菌液。
• ⑵ 消毒前采样：放置无菌规格板，取无菌棉拭 于含5ml稀释液试管中沾湿， 在规格板空心处旋 转自左至右涂抹整个区域
• ⑶ 消毒后采样：在前采样地点旁用0.05％过氧 乙酸溶液消毒物体表面，30分钟后将无菌棉 拭 于含5ml采样液试管中沾湿，作为消毒后样液。
• ⑷ 将消毒前后样液充分振荡摇匀后稀释 ⑸ 培养待凝固后37℃培养24～48小时，作菌落 计数。
灭菌效果监测
• １、高压蒸气灭菌效果监测 • (1) 高压蒸气灭菌指示卡：将卡片放入灭菌器
不同部位， 观察灭菌后指示卡颜色变化。 • (2)芽胞菌片法：将每片染有嗜热脂肪杆菌芽
胞105cfu/ml的菌片包好、放入灭菌器内。灭菌 后作细菌计数测定。 对照是不经灭菌的菌片， 芽胞完全被杀灭或杀来率达99.9999％为合格。
• 2、培养基成分
• 培养基的成分中，油脂、糖类、蛋白质 都是传热的不良介质，会增加微生物的 耐热性，使灭菌困难。
• 浓度较高的培养基相对需要较高温度和 较长时间灭菌。
• 高浓度的盐类，色素则削弱其耐热性， 故较易灭菌。
• 3、培养基中的颗粒物质
• 培养基中的颗粒物质大，灭菌困难，反 之，灭菌容易。一般说来，含有颗粒对 培养基灭菌影响不大，但在培养基混有 较大颗粒，特别是存在凝结成团的胶体 时，会影响灭菌效果，必须过滤除去。
• (2)紫外线强度与消毒剂量指示卡：
• 测定灯管强度时，将卡片置于离紫外灯 管１Ｍ的中央处，将图案一面朝向灯管， 照射一分钟（照射时间要准确）后，图 案正中涂层由白色变为紫红色。与周围 相应色块相比，可测知所照射的强度。
• 新灯管以不低于100uw/cm2为合格， 旧灯管低于70uw/cm2应更换。
• ２、紫外线消毒效果监测
• ⑴ 微型紫外线强度计：使用时打开仪器开关， 装入电池，打开电源开关 ，接通电源，将测 定电压转换开关拨至电压一方，此时指针应超 过中线。
• 测定时，将测定电压转换开关拨至测定一方， 打开紫外线灯照射２分钟后，将紫外线灯强度 计置于紫外线灯下垂直１Ｍ的中央进行照射， 直至仪表指针稳定，所示之值即为该紫外线灯 的强度值(uw/cm2) 。
• （2）过滤除菌法
• 是将液体或气体用微孔薄膜过滤，使大 于孔径的细菌等微生物颗粒阻留，从而 达到除菌目的。在体外培养时，过滤除 菌大多用于遇热容易变性而失效的试剂 或培养液。
• （3）其他方法
• 在配制培养基时，为避免发生沉淀，一 般应按配方逐一加入各种成分。
• 另外，加入0.01％EDTA或0.01％NTA （氮川三乙酸）等螯合剂到培养基中， 可防止金属离子发生沉淀。
• （二）实罐灭菌
• 将培养基置于发酵罐中用蒸汽加热，达到预定 灭菌温度后，维持一定时间，再冷却到发酵温 度，然后接种发酵，这叫做实罐灭菌，又称分 批灭菌。
• 操作要点：
• 三路进汽：直接蒸汽从通风、取样和出料口进 入罐内直接加热，直到所规定的温度，并维持 一定的时间。这就是所谓的“三路进气”。
培养基连消工艺流程图
• 密闭的深层通气发酵需严格的纯净培养，进入发酵 罐前空气必须进行冷却、脱水、脱油和过滤除菌等 处理。
（二）发酵对空气无菌程度
的要求
• 好气性发酵过程中需要大量的无菌空气，空气要 作到 绝对无菌在目前是不可能的，也是不经济 的。
• 表面消毒剂是指对一切活细胞都有毒性，不能 用作活细胞内的化学治疗用的化学药剂。
• 为比较各种表面消毒剂的相对杀菌强度，常采 用在临床上最早使用的消毒剂——石炭酸作为 比较的标准，并提出了石炭酸系数这一指标。
• 所谓石炭酸系数，指在一定时间内被试药剂能 杀死全部供试菌的最高稀释度与达到同效的石 炭酸的最高稀释度的比率。一般规定处理时间 为10分钟，而供试菌定为Salmonellatyphi（伤 寒沙门氏菌）。
二、灭菌的实际操作
• （一）空罐灭菌 • 空罐灭菌也称空消。无论是种子罐、发酵罐、
还是尿素（或液氨）罐、消泡罐，当培养基 （或物料）尚未进罐前对罐进行预先灭菌，为 空罐灭菌。 • 为了杀死所有微生物特别是耐热的的芽孢，空 罐灭菌要求温度较高，灭菌时间较长，只有这 样才能杀死设备中各死角残存的杂菌或芽孢。
• 空气中的微生物种类以细菌和细菌芽胞较多， 也有酵母，霉菌和病毒。
• 这些微生物大小不一，ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ般附着在空气中的灰 尘上或雾滴上，空气中微生物的含量一般为 103~104个／米3。
• 灰尘粒子的平均大小约0.6μm左右，所以空气 除菌主要是去除空气中的微粒(0.6-1μm ）
二、空气除菌
• 工业发酵对空气处理的要求随发酵产品和菌种不同 而异。
• 最后，还可以用气体灭菌剂如氧化乙烯 等对个别成分进行灭菌处理。
三、化学杀菌剂或制菌剂
（一）表面消毒剂
• 常用消毒剂的种类很多，它们的杀菌强度 各不相同。但几乎都有一个共同规律，即当其 在极低浓度时，常常会对微生物的生命活动起 刺激作用，随着浓度逐渐增高，就相继出现制 菌和杀菌作用，因而形成一个连续的作用谱。
发酵工程基本操作
第一节 严格消毒灭菌
• 控制有害微生物主要有以下几种措施
除菌的方法
• 培养基的加热灭菌（包括常压或蒸汽高 压加热法）
• 空气的过滤除菌 • 紫外线或电离辐射 • 化学药物灭菌
培养基的灭菌
一、影响培养基灭菌的因素
• 1、pH值的影响 • pH值对微生物的耐热性影响很
大 ， pH 为 6.0-8.0 时 微 生 物 最 不易死亡， pH <6.0时氢离子 易渗入微生物的细胞内。
第二节 空气的净化
一、空气中微生物的分布
• 空气中微生物的含量和种类，随地区，季节和 空气中灰尘粒子多少，以及人们的活动情况而 异。
• .北方气候干燥，寒冷，空气中的含菌量较多， 离地面越高，含菌量越少；一般每升高10米， 空气中的含菌量就降低一个数量级；
• 城市的空气中含菌量较多，农村的空气中含菌 量较少，一般城市空气中杂菌数为3000~8000 个／米3 。
消毒试验
• ⑴ 以人工染菌实物为消毒对象，模拟现场表面 污染大肠杆菌液。
• ⑵ 消毒前采样：放置无菌规格板，取无菌棉拭 于含5ml稀释液试管中沾湿， 在规格板空心处旋 转自左至右涂抹整个区域
• ⑶ 消毒后采样：在前采样地点旁用0.05％过氧 乙酸溶液消毒物体表面，30分钟后将无菌棉 拭 于含5ml采样液试管中沾湿，作为消毒后样液。
• ⑷ 将消毒前后样液充分振荡摇匀后稀释 ⑸ 培养待凝固后37℃培养24～48小时，作菌落 计数。
灭菌效果监测
• １、高压蒸气灭菌效果监测 • (1) 高压蒸气灭菌指示卡：将卡片放入灭菌器
不同部位， 观察灭菌后指示卡颜色变化。 • (2)芽胞菌片法：将每片染有嗜热脂肪杆菌芽
胞105cfu/ml的菌片包好、放入灭菌器内。灭菌 后作细菌计数测定。 对照是不经灭菌的菌片， 芽胞完全被杀灭或杀来率达99.9999％为合格。
• 2、培养基成分
• 培养基的成分中，油脂、糖类、蛋白质 都是传热的不良介质，会增加微生物的 耐热性，使灭菌困难。
• 浓度较高的培养基相对需要较高温度和 较长时间灭菌。
• 高浓度的盐类，色素则削弱其耐热性， 故较易灭菌。
• 3、培养基中的颗粒物质
• 培养基中的颗粒物质大，灭菌困难，反 之，灭菌容易。一般说来，含有颗粒对 培养基灭菌影响不大，但在培养基混有 较大颗粒，特别是存在凝结成团的胶体 时，会影响灭菌效果，必须过滤除去。
• (2)紫外线强度与消毒剂量指示卡：
• 测定灯管强度时，将卡片置于离紫外灯 管１Ｍ的中央处，将图案一面朝向灯管， 照射一分钟（照射时间要准确）后，图 案正中涂层由白色变为紫红色。与周围 相应色块相比，可测知所照射的强度。
• 新灯管以不低于100uw/cm2为合格， 旧灯管低于70uw/cm2应更换。
• ２、紫外线消毒效果监测
• ⑴ 微型紫外线强度计：使用时打开仪器开关， 装入电池，打开电源开关 ，接通电源，将测 定电压转换开关拨至电压一方，此时指针应超 过中线。
• 测定时，将测定电压转换开关拨至测定一方， 打开紫外线灯照射２分钟后，将紫外线灯强度 计置于紫外线灯下垂直１Ｍ的中央进行照射， 直至仪表指针稳定，所示之值即为该紫外线灯 的强度值(uw/cm2) 。
• （2）过滤除菌法
• 是将液体或气体用微孔薄膜过滤，使大 于孔径的细菌等微生物颗粒阻留，从而 达到除菌目的。在体外培养时，过滤除 菌大多用于遇热容易变性而失效的试剂 或培养液。
• （3）其他方法
• 在配制培养基时，为避免发生沉淀，一 般应按配方逐一加入各种成分。
• 另外，加入0.01％EDTA或0.01％NTA （氮川三乙酸）等螯合剂到培养基中， 可防止金属离子发生沉淀。
• （二）实罐灭菌
• 将培养基置于发酵罐中用蒸汽加热，达到预定 灭菌温度后，维持一定时间，再冷却到发酵温 度，然后接种发酵，这叫做实罐灭菌，又称分 批灭菌。
• 操作要点：
• 三路进汽：直接蒸汽从通风、取样和出料口进 入罐内直接加热，直到所规定的温度，并维持 一定的时间。这就是所谓的“三路进气”。
培养基连消工艺流程图