脂多糖对体外培养奶牛子宫内膜上皮细胞子宫容受性因子表达的影响

脂多糖对体外培养奶牛子宫内膜上皮细胞子宫容受性因子表达
的影响
冯妍; 倪和民; 郭勇; 盛熙晖; 齐晓龙; 邢凯; 王相国
【期刊名称】《《中国畜牧兽医》》
【年(卷),期】2019(046)008
【总页数】8页(P2288-2295)
【关键词】奶牛; 子宫内膜上皮细胞; 脂多糖(LPS); 子宫容受性因子
【作者】冯妍; 倪和民; 郭勇; 盛熙晖; 齐晓龙; 邢凯; 王相国
【作者单位】北京农学院动物科学技术学院北京102206
【正文语种】中文
【中图分类】S823.9+1
子宫内膜既是防御感染的屏障又是妊娠成功的关键。

产后子宫感染引起的子宫内膜细胞损伤和慢性炎症是造成奶牛繁殖障碍的主要原因，已成为严重危害奶牛场健康发展的重要疾病之一[1-2]。

目前的研究主要集中于病原的调查分析和抗菌药物的研发，临床上采用的抗生素、中药及相关生物学治疗方法等对于子宫内膜炎症，尤其是隐性子宫内膜炎引起的子宫功能紊乱的治疗效果并不理想。

因此，深入揭示子宫内膜炎发生引起奶牛不孕的调控机制，对于子宫内膜炎的防控、提高妊娠率、保证胎儿的健康具有重要的意义。

奶牛子宫内膜炎的主要致病菌包括大肠杆菌等革兰阴性菌，脂多糖
(lipopolysaccharide，LPS)是大肠杆菌细胞壁上的重要毒力因子,也是激活机体免疫反应的重要物质[3]。

研究发现，牛的子宫内膜细胞通过Toll样受体识别LPS[4]。

当信号通路被激活后，相应转录因子介导炎性介质白细胞介素-6(IL-6)、 IL-8、
IL-1β、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)信号分子等随之合成和释放[3，5-6]。

目前，家畜妊娠过程中母-胎对话机制研究主要集中在雌激素(estrogen,E2)、孕激素(progesterone,P4)、多种因子和酶类在各种动物中对早期胚胎“正确”妊娠的精确调节[7]。

对牛这种大型反刍动物而言，除了雌激素、孕激素在调节方式上与
之不同外，还有一些其他关键调节因素的差异，主要包括：干扰素τ(interferon τ,IFN-τ)、干扰素刺激基因15(interferon stimulated gene 15,ISG15)蛋白、高
度保守的分泌型WNT家族亚型糖蛋白(Wnt-7a)、大分子转膜黏蛋白-糖蛋白
1(mucin glycoprotein 1,MUC-1)、整联蛋白(integrin)和骨桥蛋白(osteopontin)[8]。

试验通过LPS诱导奶牛子宫内膜细胞，构建子宫内膜炎体外感染模型，研究子宫
内膜炎对奶牛子宫容受性因子MUC-1、Wnt-7a、β受体1(IFNAR1)、IFNAR2、Integrin αvβ3 mRNA及蛋白表达的影响，进而阐明子宫内膜炎引起奶牛屡配不
孕和繁殖率低下的分子机制，探寻防控新靶点。

1 材料与方法
1.1 材料
基础培养液DMEM/F12、胎牛血清(FBS)、双抗、磷酸盐缓冲液DPBS均购自Gibco公司；LPS(来自大肠杆菌O55∶B5)、胰蛋白酶(TE)、TritonX-100均购自Sigma公司；Cell Counting Kit-8(CCK-8)购自同仁化学研究所；小鼠单克隆角蛋白一抗、兔F(ab’)多克隆抗小鼠荧光二抗、兔抗Wnt-7a多克隆抗体均购自Abcam公司;兔抗MUC-1多克隆抗体、兔抗Integrin αv多克隆抗体、兔抗Integrin β3多克隆抗体、兔抗IFNAR1多克隆抗体、兔抗IFNAR2多克隆抗体均
购自北京嘉暄生物科技有限公司；兔抗β-actin多克隆抗体、Anti-rabbit IgG HRP-linked Antibody均购自Cell Signaling Technology；IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α酶联免疫吸附测定试剂盒均购自上海江莱生物科技有限公司；TRIzol® Reagent总RNA提取试剂购自Invitrogen USA Ltd;反转录试剂盒购自TaKaRa
公司；Real-time PCR SYBR Green Mix Kit购自北京康为世纪生物科技有限公司；蛋白抽提液、蛋白酶抑制剂均购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2 方法
1.2.1 牛子宫内膜上皮细胞的分离培养取牛子宫角，去除外层脂肪、肌肉等组织，暴露最内层半透明状膜上皮，DPBS清洗后将上皮组织剪碎至糜状，DPBS及DMEM/F-12清洗干净，静置。

待组织沉淀后，吸出上清，将上清液接种于6 cm 培养皿中，补充DMEM/F-12(20% FBS)液，轻摇培养皿，使组织块均匀的平铺于培养皿上，在37 ℃、5% CO2培养箱中进行培养；约18 h后，组织块贴壁，进
行补液。

此后每24 h进行清洗换液，5～10 d后组织边缘有细胞爬出，改为每48 h换液一次。

当细胞生长汇合度达到90%左右时，采用胰酶消化法对细胞进行传
代培养和纯化。

1.2.2 牛子宫内膜上皮细胞的鉴定将纯化好的牛子宫内膜上皮细胞传至4孔板中
培养，待细胞汇合度达到90%以上,采用免疫荧光角蛋白的方法对细胞进行纯度鉴定。

具体操作步骤如下：弃去培养液，DPBS清洗；加入4%多聚甲醛固定，DPBS振荡清洗，重复3次；弃去清洗液，加入Triton X-100通透，DPBS清洗；加入10% BSA-DPBS封闭，弃去封闭液加入稀释(1∶200)的一抗，常温震荡孵育
1 h，DPBS清洗；加入已稀释(1∶100)的二抗，避光孵育1 h，DPBS振荡清洗；加入DAPI，在避光条件下孵育10 min，DPBS避光振荡清洗3遍，保留最后一
遍的DPBS，荧光显微镜下观察并拍照[9]。

1.2.3 LPS诱导奶牛子宫内膜炎模型的建立将传至第3代的奶牛子宫内膜上皮细
胞的浓度调整为1×105个/mL，将稀释后的细胞悬液接种96孔细胞培养板，200 μL/孔，于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养。

待细胞汇合度达80%，弃去细胞培养基，DPBS洗2遍，依次加入0、5、10、50、100 μg/mL(n=6)LPS(用不含血清的无色培养基配制)，分别在孵育的第0、6、12、24和48 h每孔加入10 μL CCK-8，37 ℃继续孵育2 h，采用酶标仪测定450 nm处各孔的吸光值(D450 nm值)。

此后，将子宫内膜上皮细胞继续分为低浓度组(LPS 10 μL/mL)、模型组(LPS 100 μg/mL)和对照组(未加LPS正常培养的细胞)。

作用24 h后，收集低浓度组、模型组及对照组的细胞培养基用于ELISA检测。

取细胞培养基，1 000 g离心20 min，取上清各50 μL，加入到ELISA板中，将100 μL辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体加入每孔中，密封，37 ℃恒温箱温育60 min。

丢弃液体,用洗涤液重复洗板5次。

向每孔加各50 μL的底物A、B，37 ℃避光孵育15 min。

加入终止液50 μL,在450 nm波长处测定每孔D450 nm值。

1.2.4 实时荧光定量PCR 提取LPS处理过的奶牛子宫内膜上皮细胞总RNA,反转录合成cDNA。

根据GenBank中黄牛(Bos taurus)Wnt-7a、MUC-1、Integrin αv、Integrin β3、IFNAR1和IFNAR2及GAPDH基因序列，利用软件Primer Premier 6.0设计实时荧光定量PCR引物，引物信息见表1。

引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

按照Real-time PCR SYBR Green Mix Kit操作说明进行。

PCR反应体系25 μL：2×UltraSYBR Mixture(High ROX)12.5 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,cDNA模板1 μL，ddH2O 10.5 μL。

反应条件:95 ℃预变性10 min；95 ℃变性10 s,退火(退火温度见表1)30 s，72 ℃延伸32 s,共40个循环,反应结束后执行熔解曲线，确定反应产物的单一性。

在定量PCR仪上记录每个样本的Ct值，结果采用相对定量法，以2-△△Ct获得的数值来比较在不同的处理条件下，各基因mRNA相对于内参基因GAPDH的表达量。

表1 引物序列信息Table 1 Primer sequences information基因Genes引物序
列Primer sequences (5'→3')GenBank登录号GenBank accession No.退火温
度Annealing
temperature/℃GAPDHF:GGCGTGAACCACGAGAAGTANC_037332.157R:GG CGTGGACAGTGGTCATAAWnt-
7aF:GCTCTGCCGACATCCGCTANC_037349.157R:GTGCTTCTGGACGACCTGG MUC-
1F:GACGAAAGAAATGTGAGCAGNC_037330.153R:AAGTTGGCGGAAGTGGCI ntegrin
αvF:CAAGAGCAGCGAGGACTTTGNC_037329.153R:GCCGATAAACACATATG CGTIntegrin
β3F:CCTGAAGTCTTGCGTTGGNC_037346.153R:CGGTGAGGCTGTCTTTG IFNA R1F:GGCGTGAACCACGAGAAGTANC_037328.156R:AGATTTGCTTCCCCTGA GGCIFNAR2F:TCGTATGTTGCGCCTGTTCTNC_037332.156R:GTCCGTCGTGTT TACCCACA
1.2.5 Western blotting 提取LPS处理过和未用LPS处理的奶牛子宫内膜上皮细胞总蛋白，煮样，测定蛋白浓度。

配制12%分离胶和5%浓缩胶，待其凝固后，
进行SDS-PAGE检测，浓缩胶恒压80 V，30 min；分离胶恒压120 V，90 min。

在电流恒定200 mA条件下转膜2 h，取出PVDF膜放入封闭液中，室温振荡封
闭1～2 h。

孵育一抗，将封闭好的膜放入稀释好的抗体中(β-actin、Integrin αv、IFNAR1和IFNAR2稀释比均为1∶1 000，Wnt-7a和Integrin β3稀释比为
1∶5 000,MUC-1稀释比为1∶200)，4 ℃冰箱过夜。

一抗孵育完毕后，用TBST
振荡洗涤3次，每次10 min。

将膜放入预先稀释好的二抗(1∶1 000稀释)中，室温振荡孵育1 h。

二抗孵育完毕后，TBST洗涤3次，每次15 min,显色成像。

使
用ImageJ 2X软件进行灰度扫描定量分析。

1.2.6 数据分析所得到的数据用SPSS Statistics 19.0统计软件进行One-Way ANOVA单因素方差分析，使用Prism 7 进行图表绘制及图像分析。

2 结果
2.1 牛子宫内膜上皮细胞培养与鉴定
子宫内膜上皮细胞贴壁后表现出明显的“铺路石”的形态(图1A)。

通过组织块法获得的牛子宫上皮细胞传至第3代并通过细胞免疫荧光鉴定。

可以看出，通过组织块培养消化纯化的奶牛子宫内膜上皮细胞数量增加，纯度较好，细胞角蛋白呈明显的阳性反应，基质细胞的个数明显较少，得到的奶牛子宫内膜上皮细胞纯度约95%(图1B)。

A,奶牛子宫内膜上皮细胞(200×)；B,纯化后奶牛子宫内膜上皮细胞(400×)A,Dairy cow endometrial epithelial cells (200×);B,Purified dairy cow endometrial epithelial cells (400×)图1 奶牛子宫内膜上皮细胞培养与鉴定Fig.1 Culture and identification of dairy cow endometrial epithelial cells
2.2 不同浓度LPS对奶牛子宫内膜上皮细胞增殖的影响
试验结果显示，采用不同浓度的LPS处理子宫内膜上皮细胞后，细胞存活率呈现不同程度降低。

当LPS浓度为0、5、10、50 μg/mL，作用于细胞6、12、24、48 h后，细胞活力无明显变化，不会对细胞造成损伤，不能作为模型条件。

与对照组相比，当LPS浓度为100 μg/mL时,处理24 h后，细胞存活率显著下降
(P<0.05)，48 h后，细胞存活率极显著下降(P<0.01)(图2)。

当用LPS浓度为100 μg/mL时,处理24 h，既不会对细胞造成损伤，又不使细胞凋亡过多，产生不可逆的损伤。

与对照组相比，*,差异显著(P<0.05)；**,差异极显著(P<0.01)Compared with control group,*,Significant difference (P<0.05);**,Extremely significant difference (P<0.01)图2 LPS对子宫内膜上皮细胞活力的影响Fig.2 Effect of LPS
on endometrial epithelial cell activity
2.3 LPS对子宫内膜上皮细胞炎性因子分泌的影响
由表2可知，采用100 μg/mL LPS处理子宫内膜上皮细胞24 h后，细胞培养上清中的IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8含量均显著高于对照组及低浓度组(P<0.05)。

所以本试验拟选择100 μg/mL LPS刺激24 h建立子宫内膜炎体外感染模型。

表2 LPS对子宫内膜上皮细胞炎性因子分泌的影响Table 2 Effect of LPS on the secretion of inflammatory factors in endometrial epithelial cells炎症因子Inflammatory factors/(pg/mL)脂多糖浓度 LPS
concentration/(μg/mL)010100IL-646.54±2.10b50.35±2.55b104.45±2.26aIL-860.32±1.34b63.26±2.60b119.95±3.71aIL-
1β37.28±3.08c51.23±0.77b153.03±9.18aTNF-
α40.58±1.60b43.50±1.13b73.38±2.52a同行数据肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)；肩标相同字母或无字母标注表示差异不显著(P>0.05)。

下同In the same row,values with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05);While with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05).The same as below
2.4 LPS诱导的子宫内膜炎对奶牛子宫容受性因子mRNA表达的影响
由表3可知，与对照组相比，模型组中MUC-1 mRNA表达量极显著增加
(P<0.01),Wnt-7a、Integrin αvβ3、IFNAR1和IFNAR2 mRNA表达量极显著下降(P<0.01)。

2.5 LPS诱导的子宫内膜炎对奶牛子宫容受性因子蛋白表达的影响
由图3、表4可知，与对照组相比,模型组中MUC-1蛋白的相对表达量极显著增加(P<0.01),Wnt-7a蛋白的相对表达量极显著下降(P<0.01)，Integrin αvβ3、IFNAR1、IFNAR2蛋白相对表达量显著下降(P<0.05)。

表3 LPS诱导的子宫内膜炎对奶牛子宫容受性因子mRNA相对表达量的影响Table 3 Effect of LPS-induced endometritis on the mRNA expression of dairy cow uterine receptive factors 基因Genes对照组Control group模型组Model groupMUC-11.08±0.184.95±0.46**Wnt-
7a0.97±0.060.09±0.02**Integrin αv1.04±0.160.08±0.02**Integrin
β31.05±0.040.26±0.05**IFNAR 10.99±0.190.17±0.02**IFNAR
20.94±0.060.48±0.02**
图3 奶牛子宫容受性因子蛋白表达Fig.3 Protein expression of dairy cow uterine receptive factors
表4 LPS诱导的子宫内膜炎对奶牛子宫容受性因子蛋白相对表达量的影响Table 4 Effect of LPS-induced endometritis on the relative expression of dairy cow uterine receptive factors蛋白Proteins对照组Control group模型组Model groupMUC-10.35±0.030.51±0.02**Wnt-7a0.77±0.070.36±0.03**Integrin
αv0.95±0.050.85±0.01*Integrin
β30.68±0.060.56±0.04*IFNAR10.67±0.050.52±0.03*IFNAR20.85±0.070.67±0.02*
3 讨论
大肠杆菌是引起奶牛子宫内膜炎的重要致病菌之一，位于该细菌细胞壁部位的LPS,是激活机体免疫应答的重要物质[10]，当大肠杆菌进入子宫内膜后就能产生释放大量LPS，LPS可诱导子宫内膜组织细胞等多种靶细胞合成、分泌多种细胞因子,如IL-1β、TNF-α等，从而启动机体子宫内防御机制[3,11]。

大量研究证明，LPS能在体外诱导动物机体和多种细胞产生炎症反应[12]。

本试验中，用LPS诱导牛子宫内膜上皮细胞的免疫应答，LPS为100 μg/mL时，细胞培养上清中的IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8分泌均有大幅提高，表明成功诱导子宫内膜上皮细胞的免疫应
答。

同时，在形态学观察中，当LPS浓度为100 μg/mL时细胞形态尚未受到显著损伤，故炎症模型建立成功，可用于下一步研究。

在哺乳动物妊娠建立并完成胚胎着床的过程中，作为抗黏附因子家族代表的
MUC-1发挥重要作用[13]。

已证实在某些物种中MUC-l对胚胎的植入起阻碍作用,在母体容受性的建立过程中其下调有利于胚胎附植的顺利完成[14]。

本试验发现，MUC-1在LPS子宫内膜炎模型组呈现高表达，子宫内膜炎增加了MUC-1的抗黏附作用与MUC-1高表达防止或延迟胚胎附着可能导致胚胎死亡，促进了胚胎的丢失一致；MUC-1诱导的先天免疫效应物是抵御细菌侵入上皮表面的重要组成部分，保护生殖系统的作用，但可能同时阻碍胚胎的植入也与本研究结果相一致[15]。

整合素广泛分布于细胞表面，属于细胞黏附分子的一种。

子宫内膜上皮细胞表面存在的整合素呈时空特异性表达，胚胎着床窗口期，α1β1、αvβ3、α4β1这
3种整合素一同表达，在胚胎移植中扮演重要角色[16]。

αvβ3在黄体中期的子宫
内膜及早孕蜕膜中均有亚单位β3的表达，这与子宫内膜植入窗的开放及胚胎黏附时间同步[17-18]。

子宫对胚泡的接受状态与αvβ3的表达有密切关联，有助于子
宫内膜黏附状态的改变，是子宫内膜容受性的标志分子。

本研究中Integrin αvβ3呈显著降低的异常表达，与Anyfantaki等[19]研究结果αvβ3黏附分子在小鼠子
宫内膜炎的异常表达不适合植入相一致，影响胚胎的迁移和在子宫内膜植入部位的附着，并且与αvβ3整联蛋白表达降低，可显著减少兔和小鼠中的植入位点数量，αvβ3缺失的小鼠具有正常的植入但减少了胚胎存活和胎盘缺陷等相一致[20-21]。

许多Wnt基因受雌激素和孕激素调节，在子宫内膜的增殖、分泌和发育分化、哺
乳动物滋养层分化、子宫容受性及胚胎着床等生物过程中发挥重要作用[22-24]。

Wnt-7a对胚胎发育过程中子宫腺体发育至关重要[25]，Wnt-7a可能参与建立子
宫内膜上皮细胞与间质间的信号联系，并在“着床窗”介导了胚胎与腔上皮细胞间的起始黏附过程。

本试验结果显示，LPS模型中Wnt-7a的表达降低，与Miller
等[26]研究小鼠Wnt-7a的敲除对子宫内膜腺体形成，胚胎植入产生影响相似，并与Wnt-7a的异常表达导致新生血管的生成受到阻碍，胎盘浅着床，胚胎着床成功率降低相一致[27]。

IFN-τ由反刍动物的胚胎滋养外胚层产生，是反刍动物独有的母体妊娠识别因子[28]，在抗黄体溶解和维持妊娠方面具有重要作用[29]，通过调节其相关受体和基因，参与胚胎黏附、妊娠识别及胎盘建立[30]。

IFN-τ的受体由IFN-α或β受体1(IFNAR1)和IFN-α和β受体2(IFNAR2)组成。

IFNAR1、IFNAR2在子宫内膜的细胞中表达，在维持妊娠方面具有重要作用[31]。

在本试验中，由于细胞受到感染，IFNAR1及IFNAR2显著降低，对IFN-τ准备妊娠的识别，胚胎的黏附作用及胎盘建立产生重要影响。

与Hansen等[32]研究IFNAR的降低影响发情期间Ⅰ型IFN应答，对IFN-τ维持妊娠功能及抗黄体溶解产生抑制作用，影响胚胎的成功植入结果相一致。

4 结论
综上所述，100 μg/mL LPS作用于细胞24 h可导致细胞活力下降，产生炎症反应，细胞内IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8含量升高，可成功构建奶牛子宫内膜炎体外模型。

通过建立的子宫内膜炎模型发现，子宫内膜炎对奶牛子宫容受性因子MUC-1、Wnt-7a、IFNAR1、IFNAR2、Integrin αvβ3 mRNA及蛋白表达的影响可能是引起奶牛屡配不孕和繁殖率低下的一个重要原因。

参考文献(References) ：
【相关文献】
[1] 李生涛,崔恩慧.奶牛子宫内膜炎的研究进展[J].黑龙江畜牧兽医,2016，15:69-71.
LI S T,CUI E H.Research progress on endometritis in dairy cows[J].Heilongjiang Animal Science and Veterinary Medicine,2016,15:69-71.(in Chinese)
[2] ADNANE M,KAIDI R,HANZEN C.Risk factors of clinical and subclinical endometritis in cattle:A review[J].Turkish Journal of Veterinary & Animal Sciences,2017,41:1-11.
[3] MOLTENI M,GEMMA S,ROSSETTI C.The role of Toll-like receptor 4 in infectious and noninfectious inflammation[J].Mediators of Inflammation,2016,2016:6978936.
[4] KOO H J,YOON W J,SOHN E H,et al.The analgesic and anti-inflammatory effects of Litsea japonica fruit are mediated via suppression of NF-κB an d JNK/p38 MAPK activation[J].International Immunopharmacology,2014,22(1):50-74.
[5] LI L,LIU Y,CHEN H Z,et al.Impeding the interaction between Nur77 and p38 reduces LPS induced inflammation[J].Nature Chemical Biology,2015,11(5):339-346.
[6] WAGENER K,POTHMANN H,PRUNNER I,et al.Endometrial mRNA expression of selected pro-inflammatory factors and mucins in repeat breeder cows with and without subclinical endometritis[J].Theriogenology,2017,90:237-244.
[7] EALYA D,YANG Q E.Control of interferon-tau expression during early pregnancy in ruminants induced inflammation[J]. American Journal of Reproductive
Immunology,2009,61(2):95-106.
[8] MESELHY M R,KADOTA S,MOMOSE Y,et al.Two new quinochalcone yellow pigments from Carthamus tinctorius and Ca2+ antagonistic activity of tinctormine[J].Chemical & Pharmaceutical Bulletin,1993,41(10):1796-1802.
[9] 都日塔哈拉,曹金山,高龙,等.奶牛子宫内膜上皮细胞体外培养及鉴定[J].中国畜牧兽
医,2016,43(6):1566-1577.
DURITAHALA,CAO J S,GAO L,et al.Fostering and identifying of dairy endometrium epithelial cell in vitro[J].China Animal Husbandry & Veterinary Medicine,2016,43(6):1566-1577.(in Chinese)
[10] CARNEIRO L C,CRONIN J G,SHELDON I M.Mechanisms linking bacterial infections of the bovine endometrium to disease and infertility[J].Reproductive biology,2016,16(1):1-7.
[11] 孔维欢,代蓉,万鹏程,等.脂多糖对胚胎附植期Toll样受体4及相关免疫因子的影响[J].中国畜牧兽医,2018,45(11):3185-3191.
KONG W H,DAI R,WAN P C,et al.Effects of LPS on TRLR4 and related immune factors during embtyo implantation stage[J]. China Animal Husbandry & Veterinary Medicine,2018,45(11):3185-3191.(in Chinese)
[12] SOCHA B M,ADA P,SZCZEPANSHA A A,et al.The influence of experimentally induced endometritis.on the PPAR expression profile in the bovine
endometrium[J].Theriogenology,2018,122:74-83.
[13] RAHEEM K A,MAREI W F A,CAMPBELLB K,et al.In vivo and in vitro studies of MUC1 regulation in sheep endometrium[J].Theriogenology,2016,85(9):1635-1643.
[14] DHARMARAJ N,GENDLER S J,CARSON D D.Expressin of human MUC-1 during early pregnancy in the human MUC-1 transgenic mouse model[J].Biology of
Reproducton,2009,81(6):1182-1184.
[15] REDZOVIC A,LASKARIN G,DOMINOVIC M,et al.Mucins help to avoid alloreactivity at the maternal fetal interface[J]. Clinical and Developmental Immunology,2013,2013:542152.
[16] MISICA-TERNER P M,OBACK F C,EICHENLAUB M,et al.Aggregating embryonic but not somatic nuclear transfer embryos increases cloning efficiency in cattle[J].Biology of Reproduction,2007,76(2):268-278.
[17] GONZALE R,LEAVIS P.Leptin upregulates beta-3-integfin expression and interleukin-l beta，upregulates leptin and leptin receptor expression in human endometrial epithelial cell cultures[J].Endocrinoligy,2001,16(1):21-28.
[18] BISCHOF P,MEISSER A,CAMPANA A.Involvement of trophoblast in embryo implantation:Regulation by paracrine factors[J].Journal of Reproductive
Immunology,1998,39(1-2):167-177.
[19] ANYFANTAKI A,KYVELIDOU C,TSAQKARAKI M,et al.Differential integrin expression in pre-implantation embryos developing under in vivo and in vitro
conditions[J].Reproductive Biology,2018,18(3):221-217.
[20] LLERA M J,LORENZ O P L,GUI Y,et al.A role for αvβ3 integrin during implantation in the rabbit model[J].Biology of Reproduction,2003,68(3):766-771.
[21] HOVDIVALADILKE K.Alphavbeta3 integrin and angiogenesis:A moody integrin in a changing environment[J].Current Opinion in Cell Biology,2008,20(5):514-519.
[22] KATAYAMA S,ASHIZAWA K,FUKUHARA T,et al.Differential expression patterns of Wnt and beta-catenin/TCF target genes in the uterus of immature female rats exposed to
17alpha-ethynyl estradiol[J].Toxicological Sciences,2006,91(2):419-430.
[23] CARSON D D,BACHI I,DEY S K,et al.Embryo implantation[J].Developmental Biology,2000,223(2):217-223.
[24] HAYASHI K,BURGHARDT R C,BAZAERF W,et al.WNTs in the ovine uterus:Potential regulation of periimplantation ovine conceptus
development[J].Endocrinology,2007,148(7):3496-3506.
[25] MOHOMED O A,JONNAERT M,LABELLED C,et al.Uterine Wnt/β-catenin signaling is required for implantation[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2005,102(24):8579-8584.
[26] MILLER C,SASSOON D A.Wnt-7a maintains appropriate uterine patterning during the development of the mouse female reproductive tract[J].Development,1998,125(16):3201-3211.
[27] FAN X,KRIEG S,HWANG J Y,et al.Dynamic regulation of Wnt7a expression in the primate endometrium:Implications for postmenstrual regeneration and secretory transformation[J].Endocrinology,2012,153(3):1063-1069.
[28] 张金凤，侯振中.反刍动物妊娠识别基因IFNT的发现及其抑制黄体溶解的分子机制[J].黑龙江
畜牧兽医，2014,1:36-38.
ZHANG J F,HOU Z Z.Discovery of ruminant pregnancy recognition gene IFNT and its molecular mechanism of inhibition of luteal dissolution[J].Heilongjiang Animal Science and Veterinary Medicine,2014,1:36-38.(in Chinese)
[29] KELSEY B,BERNS G,SPENCER T E.Conceptus elongation in ruminants:Roles of progesterone,prostaglandin,interferon tau and cortisol[J].Journal of Animal Science and Biotechnology,2015,2:151-162.
[30] 李瑞婷，靳方圆，杨洪娟，等.干扰素-τ在反刍动物早期妊娠胚胎着床过程中的研究进展 [J].黑龙江畜牧兽医，2016,5:87-89.
LI R T,JIN F Y,YANG H J,et al.Research progress of interferon-τ in early pregnancy embryo implantation in ruminants[J].Heilongjiang Animal Science and Veterinary
Medicine,2016,5:87-89.(in Chinese)
[31] WANG W,LIU R,LIANG X.Expression of IFNAR1 and IFNAR2 in cattle placenta during early pregnancy[J].Reproduction in Domestic Animals,2018,53(2):385-392.
[32] HANSEN T R,HENKES L K,ASHLEY R L,et al.Endocrine actions of interferon-tau in ruminants[J].Society for Reproduction and Fertility Supplement,2010,67(1):325-340.。