芍药GA-20氧化酶基因的克隆和功能分析

芍药GA-20氧化酶基因的克隆和功能分析芍药(Paeonia lactiflora Pall.)隶属于芍药科芍药属,是重要的宿根花卉,长期演化过程中,形成了芽冬季休眠的特性。

克隆并研究芽休眠解除过程中重要基因,是解析芍药芽内休眠分子机理的重要内容。

赤霉素(gibberellins,GAs)作为一种重要的植物激素,参与控制种子、芽的萌发,茎的伸长,叶片伸展,根的生长以及花和果实的发育等多种植物发育和生理过程。

前人研究表明:赤霉素可以完全代替或部分代替低温解除或辅助解除休眠。

GA20–氧化酶(GA20ox)是赤霉素生物合成过程中的关键限速酶,调控具有活性GAs的生物合成数量。

因此,从分子生物学水平阐明GA20ox基因与芍药内休眠的关系,可能为提前解除内休眠提供新策略,具有重要理论和实践意义。

迄今为止,芍药中尚未分离到GA20ox基因。

为此,本研究拟基于前期的芍药芽转录组数据,克隆芍药GA20ox基因的cDNA全长序列,着重研究其在芍药芽内休眠解除进程中的表达特性,并进行了简单的功能鉴定,以期进一步揭示其生物学功能,并为阐明芍药芽内休眠解除的分子机理奠定基础。

本试验主要研究结论如下:(1)克隆了芍药赤霉素生物合成途径中的GA20ox 基因的cDNA全长序列。

GenBank登录号为KU886552,该基因cDNA序列全长1351 bp,开放阅读框1146 bp,共编码381个氨基酸;(2)PlGA20ox蛋白分子量为43209.1 Da,为稳定蛋白,无跨膜结构域,无信号肽,属于C19-GAoxs。

含有高度保守的20G-Fe(II)-Oxy蛋白结构域、Fe2+结合位点和2-酮戊二酸结合位点。

与牡丹GA20ox同源性高达96%,亲缘关系最近,说明GA20ox基因在遗传进化方面较为保守且符合遗传进化规律;(3)芍药GA20ox基因在芽中表达丰度最高,其次是花瓣,而在根、萼片、叶片及茎中表达微弱,说明该基因属于组成型
表达基因,但表达水平存在较明显差异;(4)在低温解除芍药芽内休眠进程
中,PlGA20ox表达水平呈先上升后总体下降趋势,且与内源GA3含量成显著正相关(r=0.901*);外施赤霉素会明显增加内源GA3含量,但同时抑制PlGA20ox的表达,说明PlGA20ox调控GA3的合成,同时受植物体内活性GA3含量的负反馈调节;(5)构建融合表达载体pROKII-PlGA20ox-GFP,利用农杆菌介导法瞬时表达本生烟(Nicotiana benthamiana)叶片显示:PlGA20ox蛋白定位于细胞质中。

(6)异源转化拟南芥,对转基因植株进行表型的观测和相关形态指标的测定,初步揭示芍药GA20ox基因的功能。

结果表明:超表达PlGA20ox基因的拟南芥与野生型拟南芥相比,能够提早抽薹,促进根的伸长、叶片伸展以及茎的增高和加粗,但对拟南芥种子的萌发无明显的促进作用。