甜菜胞囊线虫抗性基因及遗传工程改良策略

摘要 甜菜胞囊线虫（ Ｈ ｅ ｔ ｅ ｒ ｏ ｄ ｅ ｒ ａｓ ｃ ｈ ａ ｃ ｈ ｔ ｉ ｉ ） 是甜菜的重要病害之一， 给甜菜生产造成了极大的损 失。随着分子生物学和遗传工程技术的发展， 采用遗传工程改良策略进行甜菜抗性品种选育是 甜菜胞囊线虫防治中最经济、 有效的方法。介绍了甜菜胞囊线虫的生育史及抗性机制， 综述了甜 菜胞囊线虫抗性基因的克隆和鉴定研究进展及甜菜胞囊线虫抗性育种的遗传工程改良策略， 并 提出今后甜菜胞囊线虫抗性育种的展望。 关键词 甜菜胞囊线虫 抗性 抗性基因 遗传工程改良
体产生， 但这些合胞体由于亲和反应的原因不能正常 发育， 它们经历了液泡形成期后， 合胞体开始瓦解， 二
１ ３ ］ 。至少已有 龄幼虫或三龄幼虫因得不到营养而死亡 ［
３个不同抗性基因（ Ｈ ｓ １ ， Ｈ ｓ ２和 Ｈ ｓ ３ ） 定位在不同染色体 上被鉴定和分离出来， Ｈ ｓ １位于所有甜菜品种的第 １条 同源染色体上， 位于 Ｂ ．ｐ ｒ ｏ ｃ ｕ ｍ ｂ ｅ ｎ ｓ 和Ｂ ．ｗ ｅ ｂ ｂ ｉ ａ ｎ ａ 的第 ７条同源染色体上， Ｈ ｓ ３在 Ｂ ． ｗ ｅ ｂ ｂ ｉ ａ ｎ ａ 的第 ８条染色体
Ｍ ｉ 、 Ｇ ｐ ａ ２ 、 Ｈ ｅ ｒ ｏ 是定位在细胞质中属 Ｎ Ｂ Ｓ Ｌ Ｒ Ｒ抗性基 因， 这类抗性基因 Ｎ端不含与果蝇 Ｔ ｏ ｌ ｌ 蛋白及哺乳动 Ｔ Ｉ Ｒ结构域） ， 而 物白细胞介素受体胞外相似结构域（
９ ］ Ｇ ｒ ｏ １ ４基因属 Ｔ Ｉ Ｒ Ｎ Ｂ Ｓ Ｌ Ｒ Ｒ 抗性基 因 ［ 。Ｇ ｐ ａ ２与 抗

。
采用种间杂交的方法已将 Ｂ ．ｐ ｒ ｏ ｃ ｕ ｍ ｂ ｅ ｎ ｓ 的抗性基 因引入甜菜栽培品种里， 但由于野生甜菜携带有如种 子低活力、 块根发育不良和多年生等不利性状， 在生产 上难以直接利用， 需通过不断反复回交剔除不利性状。 目前携带了野生甜菜抗性基因的二倍体甜菜已在世界
１ ８ １ ９ ］ ， 这些品系遗传了 ７ ０ ． ６ ％ ～ 各地被筛 选 和 利 用 ［
收稿日期： ２ ０ １ ２ ０ ６ １ ５ 修回日期： ２ ０ １ ２ ０ ８ １ ３ ３ １ ０ ７ １ ４ ４ ３ ） 、 农业部转基因生物新品种培育 国家自然科学基金（ 重大专项（ ２ ０ １ １ Ｚ Ｘ ０ ８ ０ ０ ４－ ０ ０ ４－ ０ ０ ９ ） 资助项目 电子信箱： ｔ ａ ｎ ｇ ｇ ｘ ＠ｚ ｊ ｕ ． ｅ ｄ ｕ ． ｃ ｎ 通讯作者，
中国生物工程杂志 Ｃ ｈ ｉ ｎ ａＢ ｉ ｏ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ， ２ ０ １ ２ ， ３ ２ （ １ ０ ） ： ９ ９ １ ０ ５
甜菜胞囊线虫抗性基因及遗传工程改良策略
章洁琼１ 蔡大广２ 唐桂香１ （ １浙江大学农业与生物技术学院作物科学研究所 杭州 ３ １ ０ ０ ５ ８ ２德国基尔大学分子植物病理研究所 基尔 Ｄ ２ ４ １ １ ８ ）
［ １ ］
０ ０多个 解形成层细胞原生质体融合产生， 它能整合 ２ 细胞， 成为一个营养细胞单位， 从而大大提高细胞质的
２ ］ 新陈代谢能力 ［ 。由于雌性幼虫比雄性幼虫需要更多
的食物， 因此合胞体的数量与质量决定了线虫的性分
３ ］ 。雄性线虫发育成三龄幼虫（ Ｊ ３ ） 时停止取食， 然 化［
后三龄幼虫蜕变成蠕虫状， 经蜕皮后， 发育成了四龄幼 Ｊ ４ ） ， 再次蜕皮后， 它穿过幼虫角质层迁移出来， 通 虫（ 过分泌性信息素寻找雌性线虫交配， 交配完成后， 雄性 线虫停止发育并死亡， 雌性线虫则发育变成胞囊。关 于线虫营养单位合胞体诱导和引发的分子机制目前还 不清楚， 但有研究证明在合胞体营养细胞形成过程中，
具有功能的合胞体， 这主要与根组织过敏反应导致线
３ ］ 虫死亡有关 ［ 。目前植物产生线虫抗性反应主要有三
种类型， 第一种是由 Ｈ ｅ ｒ ｏ 基因介导的抗性反应， 它在合 胞体刚开始诱导时就发生， 使合胞体周围细胞坏死最
１ ０ ］ ； 第二种是对 Ｍ ｅ ｌ ｏ ｉ ｄ ｏ ｇ ｙ ｎ ｅ 属根结线虫的抗性 后降解 ［
１ ４ ］ 亡［ ， 极少量幼虫能够侵入维管束中柱细胞诱导合胞
产上证明是低效和不经济的； 生物防治如采用线虫病
２ ４ ］ 原真菌 ［ 和种植线虫诱捕植物的方法。诱捕植物指能
够诱导雌性线虫孵化， 但不能完成整个生活史， 可显著 降低田间胞囊的密度和侵染率， 许多芸苔属作物如白 芥子（ Ｓ ｉ ｎ ａ ｐ ｉ ｓ ａ ｌ ｂ ａ ） 或萝卜（ Ｒ ａ ｐ ｈ ａ ｎ ｕ ｓ ｓ ａ ｔ ｉ ｖ ｕ ｓ ） 等是良好 的诱捕作物。作物轮作是防治胞囊线虫的有效方法， 但许多与甜菜轮作的作物如藜科的菠菜和十字花科的 油菜都是甜菜胞囊线虫的良好寄主。因此， 种植抗线 虫品种是甜菜胞囊线虫防治最有效和直接的方法。通 过线虫抗性基因的克隆， 利用遗传工程改良策略， 将是 获得抗线虫的甜菜品种最快捷有效的方法。
马铃薯 Ｘ病毒的 Ｒ ｘ 基因在氨基酸序列上具有高度相
３ ２ ３ ３ ］ 似性 ［ ， 它们都位于马铃薯第 １ ２条染色体的相同基
因簇上， 虽然所抗的病原菌不同， 但这两个基因具有高
３ ０ ３ ４ ］ 。而对马 度的同源性， 很可能来自于同一个祖先 ［
铃薯金线虫（ Ｇ ．ｒ ｏ ｓ ｔ ｏ ｃ ｈ ｉ ｅ ｎ ｓ ｉ ｓ ） 具有抗性的 Ｇ ｒ ｏ １和 Ｈ ｅ ｒ ｏ
２ ７ ］ 也有一定的抗性 ［ ， 且Ｍ ｉ 基因还对马铃薯长管蚜、 马 ２ ８ ２ ９ ］ 铃薯白飞虱和烟草粉虱也具有抗性 ［ 。从马铃薯中
１ ０ ０ ％线虫抗性， 因此利用这些品系用于育种材料和抗 性基因的克隆已成为可能。利用 Ｒ Ｆ Ｌ Ｐ分子标记技术 已建立了含有 ４个无关联易位基因的甜菜图谱， 结果 是这 ４个基因被定位在同一染色体同一位置上， 并不
在商业化应用的甜菜抗线虫品种中发现， 这些抗 线虫 品 种 的 亲 本 绝 大 部 分 来 自 Ｂ ｅ ｔ ａｖ ｕ ｌ ｇ ａ ｒ ｉ ｓｓ ｓ ｐ ． Ｍ ａ ｒ ｉ ｔ ｉ ｍ ａ ， 除了抗线虫外还抗根肿病。这些抗性品种不 能阻止胞囊线虫的侵染， 但可以阻碍线虫的发育， 减少 田间雌性线虫的数量。甜菜胞囊线虫的抗性取决于线 虫的侵染力， 但往往抗性品种伴随着不利性状如低产 量， 因此在田间线虫侵染力较低的情况下不能发挥很
２ ２ ２ ３ ］ ； 物理防治如淹水、 土壤隔离和清除胞囊等在生 用［
。
目 前 甜 菜 线 虫 抗 性 的 研 究 已 经 扩 展 到 甜 菜 属 （ Ｂ ｅ ｔ ａ ）的 ４ 个 分 支 甜 菜 组 （ Ｂ ｅ ｔ ａ ｅ ） 、 白花甜菜组 （ Ｃ ｏ ｒ ｏ ｌ ｌ ｉ ｎ ａ ｅ ） 、 矮生甜菜组（ Ｎ ａ ｎ ａ ｅ ）和 匍 匐 甜 菜 组 （ Ｐ ｒ ｏ ｃ ｕ ｍ ｂ ｅ ｎ ｔ ｅ ｓ ） 。在栽培甜菜（ Ｂ ．ｖ ｕ ｌ ｇ ａ ｒ ｉ ｓ ） 中没有发现 Ｐ ｒ ｏ ｃ ｕ ｍ ｂ ｅ ｎ ｔ ｅ ｓ ） 中 胞囊线虫抗性品种， 而在匍匐甜菜组（ 如平 匍 甜 菜 （ Ｂ ．ｐ ｒ ｏ ｃ ｕ ｍ ｂ ｅ ｎ ｓ ） 、 维比亚纳甜菜（ Ｂ ． ｗ ｅ ｂ ｂ ｉ ａ ｎ ａ ） 和小碗花甜菜（ Ｂ ．ｐ ａ ｔ ｅ ｌ ｌ ａ ｒ ｉ ｓ ） 中发现了胞囊线 虫抗性品种。 Ｐ ｒ ｏ ｃ ｕ ｍ ｂ ｅ ｎ ｔ ｅ ｓ 甜菜品种根被胞囊线虫幼 虫侵染 后 会 引 起 皮 层 细 胞 坏 死 导 致 大 部 分 线 虫 死
４ ６ ］ 线虫在转录组水平产生了很大的变化 ［ 。
， Ｈ ．ｓ ｃ ｈ ａ ｃ ｈ ｔ ｉ ｉ 侵染甜菜根部诱导巨
１ ． ２ 胞囊线虫抗性机制 植物能否产生线虫抗性与合胞体是否正常发育密 切相关。植物对胞囊线虫抗性的反应具有延迟应答的 特点， 在合胞体建立数天后才发生抗性反应， 合胞体瓦
中图分类号 Ｑ ７ ８ ９ 线虫是甜菜（ Ｂ ｅ ｔ ａｖ ｕ ｌ ｇ ａ ｒ ｉ ｓ Ｌ ． ） 栽培过程中最严重 的病害， 它能引起甜菜根冠数量减少， 产量下降 ２ ５ ％～ ５ ０ ％。甜 菜 线 虫 中 危 害 最 严 重 的 是 异 皮 线 虫 属 （ Ｈ ｅ ｔ ｅ ｒ ｏ ｄ ｅ ｒ ａ ） 的胞囊线虫（ Ｈ ｅ ｔ ｅ ｒ ｏ ｄ ｅ ｒ ａｓ ｃ ｈ ａ ｃ ｈ ｔ ｉ ｉ ） 和茎线虫 属（ Ｄ ｉ ｔ ｙ ｌ ｅ ｎ ｃ ｈ ｕ ｓ ｄ ｉ ｐ ｓ ａ ｃ ｉ ） 、 毛刺线虫属（ Ｔ ｒ ｉ ｃ ｈ ｏ ｄ ｏ ｒ ｕ ｓ ） 和长 针线虫属（ Ｌ ｏ ｎ ｇ ｉ ｄ ｏ ｒ ｕ ｓ ） 的部分物种。 Ｈ ．ｓ ｃ ｈ ａ ｃ ｈ ｔ ｉ ｉ 是Ｈ ． 在１ ８ ５ ９年首次在种植甜菜多年连作贫瘠的的 Ｓ ｃ ｈ ａ ｃ ｈ ｔ ｉ ｉ ８ ７ １年 才 由 Ａ ．Ｓ ｃ ｈ ｍ ｉ ｄ ｔ 命名为 土 壤 里 发 现， 直到 １ Ｈ ｅ ｔ ｅ ｒ ｏ ｄ ｅ ｒ ａｓ ｃ ｈ ａ ｃ ｈ ｔ ｉ ｉ ， 它的主要特征是雌虫为直径小于 １ ｍ ｍ的柠檬状体， 寄主范围广， 许多芸薹属和藜属如甜 菜、 油菜、 菠菜及杂草等 ２ ０ ０多种植物都是它的寄主。 迄今为 止 已 在 ４ ０多 个 国 家 发 现 甜 菜 胞 囊 线 虫 （ Ｈ ． ｓ ｃ ｈ ａ ｃ ｈ ｔ ｉ ｉ ） 的危害
７ ９ ］ 解线虫发育停滞 ［ 或者线虫侵染植物根后不能产生
型营养细胞的产生， 作为寄生生长与繁殖的营养源。
１ 甜菜胞囊线虫的防治
１ ． １ 甜菜胞囊线虫的生育史 发育成熟的雌胞囊线虫被称为胞囊， 胞囊内含有 很多卵， 卵在适宜条件下能孵化出具侵染能力的二龄 幼虫（ Ｊ ２ ） ， 这些二龄幼虫在植物根内向正在分化的维 管束细胞移动， 并诱导产生多核细胞即合胞体。合胞 体是胞囊线虫取食的营养单位， 它是由部分细胞壁溶
些特殊膜聚集， 使合胞体不能正常发育， 最后导致合胞 体瓦解和线虫幼虫死亡
［ １ ３ ］
好的优势。在一块地里线虫侵染力越高， 耐线虫品种 种植带来的经济效益就越高。 １ ． ３ 甜菜胞囊线虫的防治策略 生产上主要通过化学、 物理和生物防治的方法来 控制甜菜胞囊线虫， 常采用作物轮作、 杀线虫剂烟熏法 及种植抗性品种等。在甜菜生产过程中， 由于杀线虫 剂的使 用 会 对 环 境 造 成 不 良 影 响， 目前已被禁止使
反应， 它能 快 速 地 引 起 定 点 细 胞 死 亡， 产生大量活性
１ １ １ ２ ］ 氧， 使得已建立的合胞体分解和线虫死亡 ［ ； 第三种
是在野生抗胞囊线虫甜菜品种中发现的， 合胞体被一
１ ０ ０
中国生物工程杂志 Ｃ ｈ ｉ ｎ ａＢ ｉ ｏ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ
Ｖ ｏ ｌ ． ３ ２Ｎ ｏ ． １ ０２ ０ １ ２
１ ５ １ ７ ］ 上［ 。用致毒力强的胞囊线虫侵染含有不同抗性基
因的甜菜发现位于 １号染色体上的 Ｈ ｓ １能对胞囊线虫 产生抗性， 而 ７号染色体上的 Ｈ ｓ ２则不能产生抗性
［ １ ７ ］
２ 甜菜胞囊线虫抗性基因研究
ｐ ｒ ｏ １ ７ ］ Ｈ ｓ １ 是德国基尔大学 Ｃ ａ ｉ 等［ 从野生甜菜中克
隆的第一个胞囊线虫抗性基因， 之后在很多植物中分 ｉ １和 离了许多线虫抗性基因。从野生番茄克隆的 Ｍ
２ ５ ２ ６ ］ Ｈ ｅ ｒ ｏ 基因对番茄根结线虫具有广谱抗性 ［ ， 同时对
马铃薯金线虫（ Ｇ ．ｒ ｏ ｓ ｔ ｏ ｃ ｈ ｉ ｅ ｎ ｓ ｉ ｓ ） 和白线虫（ Ｇ ．ｐ ａ ｌ ｌ ｉ ｄ ａ ）
２ ０ ］ 依赖于它 们 的 原 始 易 位 ［ ， 进一步利用易位品系和 ｐ ｒ ｏ １ Ｈ ｓ １ 探针进行荧光原位杂交发现 ９ ４ ０ ０ ４ ３品系的易位 ２ １ ］ 点发生在 ９号染色体的末端 ［ 。
克隆的线虫抗性基因 Ｇ ｐ ａ ２和 Ｇ ｒ ｏ １ ４只对马铃薯胞囊
３ ０ ３ １ ］ 线虫（ Ｇ ．ｐ ａ ｌ ｌ ｉ ｄ ａ ） 有部分抗性， 居间抗性范围较窄 ［ 。