连翘叶中活性成分提取及对豆腐防腐作用的研究

沈阳化工大学本科生毕业论文
题目：连翘叶中活性成分提取及对豆
腐防腐作用的研究
院系：制药与生物工程学院
专业：生物工程
班级：生物工程1102
学生姓名：郭世铭
指导教师：刘桂萍
论文提交日期：年月日
论文答辩日期：年月日
毕业设计（论文）任务书
生物工程专业1102班学生：郭世铭
毕业设计（论文）题目：连翘叶中活性成分提取及对豆腐防腐作用的研究
毕业设计（论文）内容：利用微波辅助水提连翘叶中总黄酮，考察料液比、时间、功率、提取次数等对总黄酮提取率的影响，通过单因素实验和正交实验确定最佳提取条件，并探究连翘叶提取液对豆腐防腐的作用。

毕业设计（论文）专题部分：1、微波辅助对连翘叶中总黄酮提取2、探究粗提液对豆腐防腐的作用效果3、探究连翘叶粗提液与壳聚糖复配对对豆腐防腐的作用效果
起止时间：2015年3月---2015年6月
指导教师：签字年月日教研主任：签字年月日学院院长：签字年月日
毕业设计（论文）诚信承诺书
本人郑重承诺此处所提交的学位论文是在指导教师的指导下，严格按照学校和学院（系）有关规定完成的。

论文中引用他人的观点和参考资料均加以注释和说明。

在本人的毕业论文中未剽窃、抄袭他人的学术观点、思想和成果，未篡改研究数据，如有违规行为发生，我愿承担一切责任并接受学校的处理。

作者签名：日期：年月日
关于学位论文使用授权的说明
本论文的研究成果归沈阳化工大学所有，本论文的研究内容不得以其它单位的名义发表。

本学位论文作者和指导教师完全了解沈阳化工大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权沈阳化工大学可以将论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索、交流，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。

（保密的论文在解密后应遵循此规定）
作者签名：导师签名：日期：年月日
摘要
连翘Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl，木犀科连翘属，是我国著名的中草药，果实又名落翘，青翘等。

研究表明，连翘味苦，无毒，性微寒，在中药中具有镇吐、利尿、强心、抗菌、抗氧化功能等药理作用，历来被视为疮家圣药。

连翘叶子与果实的药理成份相似，作用相同，研究对叶子中活性成分的提取，在医药活性成分提取以及对连翘利用方面具有重大意义。

实验采用2014年7月干燥连翘叶，在微波条件下以提取时间、微波提取功率、料液比、微波提取次数为影响条件设计单因素实验，以提取液中芦丁含量为指标，通过硝酸铝显色法对连翘叶中总黄酮类化合物提取率进行计算，通过对比不同条件的影响因素，设计4因素3水平正交实验，得出最佳提取条件；将提取的溶液配比成不同浓度梯度的溶液以及与壳聚糖的复配溶液探讨连翘叶水提物的防腐作用。

实验结果表明，在对各个因素进行分析后，得出微波最佳提取条件为：微波提取即料液比1：23，提取时间2.3min，提取功率640W，提取3次，提取率为16.35%，黄酮含量为0.409mg/ml。

连翘叶粗提物对豆腐中微生物有一定的抑制作用，延长了其保存时间：当连翘叶提取物质量浓度为0.025g/ml时就表现出一定的防腐效果，且防腐效果随粗提物质量浓度的增加而加强；当连翘叶提取物质量浓度为0.1g/ml时，可使豆腐的保质期由1天延长至3天，在等同条件下，将连翘水提溶液与壳聚糖溶液按1:1的比例复配处理豆腐，与未加壳聚糖溶液的相比，同浓度的复配溶液处理的豆腐的腐败程度更低，效果更好。

关键词：连翘叶；黄酮；提取；微波；防腐
Abstract
Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl, oleaceae forsythias class, the oth ername become warped, such as green become warped. With sickness, diuresis, cardiac, antibacterial forsythia, anti-oxidation function, etc. Bitte r taste,non-toxic, small cold, the doctor of traditional Chinese medicine used to qingrejiedu, has long been seen as sore effective medicine.
Research under the condition of microwave extraction yield of total flavonoids in the leaves and stems of forsythia changes, comparing the influence factors of different conditions, obtain the best extraction para meters; Using extraction of crude extract bean curd antiseptic experimen t.
Forsythia leaves take in 2014 and dry, with high-speed universal g rinder grinding, dry place preservation. Set aside. Extracted by microwa ve extraction time, microwave power, material liquid ratio, microwave e xtraction times as a variable for single factor experiment, in order to g et the trend of each single factor, and then choose the best extraction c onditions were analyzed, and the single factor of orthogonal experiment, finally obtain the optimal extraction conditions; Ratio of the extracted solution into the solution of different concentration gradient and the co mpound with chitosan solution anticorrosion performance of eucommia ulmoides leaf aqueous extract are discussed.
The results showed that, after the analysis of the factors, the optim um extraction conditions for microwave, microwave extraction time is 2.
3 min, power 640 w, and solid-liquid ratio 1:17, extracting 2 times, ext raction rate is 16.03%; Crude extractings from forsythia leaves of bean curd of microorganism has certain inhibition, prolong the preservation ti me. As st John's wort leaf extract concentration is 0.025 g/ml will sho
w some anticorrosive effect, and anti-corrosion effect enhance with the increase of mass concentration of crude extract; As st John's wort leaf extract concentration is 0.1 g/ml, can extend the shelf life of tofu by 1 day to 3 days, under equal conditions, forsythia aqueous solution with chitosan solution according to 1:1 proportion distribution of processing bean curd, compared with no chitosan solution with the concentration of the mixed solution processing tofu corruption levels lower, more effe ctive.
Key words: forsythia leaves; Flavonoids; Extraction; Microwave; Corros ion protection
目录
引言 (1)
第一章文献综述 (2)
1.1 连翘 (2)
1.1.1 连翘叶 (2)
1.1.2 连翘叶的用途 (2)
1.2 类黄酮 (3)
1.2.1 类黄酮的结构和分类 (3)
1.2.2 类黄酮的来源 (4)
1.2.3 类黄酮的提取 (4)
1.2.3.1 溶剂提取 (4)
1.2.3.2 超声波辅助提取 (4)
1.2.3.3 酶法提取 (5)
1.2.3.4 超临界流体萃取技术 (5)
1.2.3.5 微波法连翘叶类黄酮的提取 (5)
1.2.4 类黄酮对细菌的抑制 (6)
1.3 常用检测方法 (6)
1.3.1 紫外-可见分光光度法 (6)
1.3.2 高效液相色谱法（HPLC） (6)
第二章实验材料及装置仪器 (8)
2.1 实验材料 (8)
2.1.1 原料预处理 (8)
2.1.2 实验药品 (8)
2.2 实验仪器与设备 (8)
2.3 实验方案 (9)
2.3.1 方案确定 (9)
2.3.2 配制芦丁标准溶液制定工作曲线回归方程 (9)
2.3.3 类黄酮的提取与测定 (10)
2.3.3.1 类黄酮的提取工艺流程 (10)
2.3.3.2 类黄酮的测定 (10)
2.3.4 微波水提法单因素实验 (10)
2.3.4.1 微波时间 (10)
2.3.4.2 料液比 (10)
2.3.4.3 微波功率 (11)
2.3.4.4 提取次数 (11)
2.3.4.5 微波水提法正交实验 (11)
2.3.5 连翘叶提取物对豆腐的保鲜作用研究 (11)
2.3.5.1 豆腐防腐试实验步骤 (11)
2.3.5.2 连翘提取物与壳聚糖联合防腐实验步骤 (12)
2.3.5.3 豆腐质量评价测定方法 (12)
第三章实验结果分析及讨论 (13)
3.1 芦丁标准曲线的绘制 (13)
3.2 微波辅助提取 (13)
3.2.1 单因素 (13)
3.2.1.1 微波时间对总黄酮提取率的影响 (13)
3.2.1.2 料液比对总黄酮提取率的影响 (14)
3.2.1.3 微波功率对总黄酮提取率的影响 (15)
3.2.1.4 提取次数对总黄酮提取率的影响 (15)
3.2.1.5单因素实验结果分析 (16)
3.2.2 正交实验结果 (16)
3.3.1 连翘叶提取物对豆腐防腐定性实验结果与分析 (18)
3.3.1.1 豆腐感官变化 (18)
3.3.1.2 豆腐表面霉菌生长情况 (20)
3.3.1.3 豆腐表面的pH值变化 (20)
3.3.2 连翘叶提取物和壳聚糖联合作用对豆腐实验结果与分析21
3.3.2.1 豆腐感官变化 (21)
3.3.2.2 豆腐表面霉菌生长情况 (23)
3.3.2.3 豆腐表面的pH值变化 (24)
第四章结论 (26)
4.1 微波辅助水提法提取连翘叶中黄酮类化合物实验结论 (26)
4.2 连翘叶粗提溶液以及复配溶液在豆腐防腐作用实验结论 (26)
参考文献 (27)
致谢 (29)
引言
连翘Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl，木犀科连翘属，是我国著名的中草药，果实又名落翘，青翘等。

研究表明，连翘味苦，无毒，性微寒，在中药中具有镇吐、利尿、强心、抗菌、抗氧化功能等药理作用，历来被视为疮家圣药。

连翘叶子与果实的药理成份相似，作用相同，研究对叶子中活性成分的提取，在医药活性成分提取以及对连翘利用方面具有重大意义。

本次实验采取微博辅助水提取法研究连翘花中类黄酮物质的分离提取优化工艺，计算最佳提取率，探究其对豆制品防腐作用以及提取物与壳聚糖溶液混合对豆制品防腐作用的效果。

第一章文献综述
1.1 连翘
连翘Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl，木犀科连翘属类，另名落翘，青翘等。

连翘具有镇吐、利尿、强心、抗菌连翘、抗氧化功能等性质作用。

[1-2]近些年来，越来越多的科学家对从自然界中寻求的天然产物的研究高度重视。

连翘味苦，无毒，性微寒，中医常用来清热解毒，历来被视为疮家圣药。

从连翘中提取的黄酮类化合物是具有抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗病毒等多种生理活性，其药理性质也可用于治疗心脑血管等疾病[3]。

研究者对连翘中的黄酮类化合物通常采用水提法、碱液提取法、醇回流法、醇渗漉法、浸渍法等方法进行提取。

[4]本次实验是通过微波辅助水提法探究黄酮类化合物提取工艺条件，并对该提取方法优化，同时用提取溶液进行豆腐防腐作用的研究。

1.1.1 连翘叶
张建红（2005）[5]检测连翘叶中黄酮的含量，黄酮类化合物得率为8.35%以芦丁为对照品，采用比色法在波长275nm处测出总黄酮含量是69.2%，采用高效液相色谱（HPLC）法测得其中芦丁含量为22.28%。

对不同月份的连翘叶含量比较，发现8月份采摘的连翘叶中芦丁的含量最高为2.372%[6]
1.1.2 连翘叶的用途
作为药用历史悠久的中草药，连翘以果实为主入药。

连翘以其具有抗氧化活性、抗菌活性、抗病毒活性、抗肿瘤活性以及解热镇痛活性等功效，成为清热解毒药物的主要原料。

目前，如双黄连口服液、双黄连注射液、连翘解毒片等[7]在内的有数十种药物都含有连翘得活性成分。

除了连翘的果实有药用价值外，其自身茎、叶以及花的提取物也有抑菌等药用价值，对高血压、痢疾、咽喉痛等具有较好的治疗效果，连翘根可治疗湿热疾病。

连翘还具有抗肝损伤、抗菌、抗肿瘤和抗氧化等临床活性作用。

侯改霞[8]采用ICR 健康小鼠，以复制高脂血症建立模型，分析连翘叶提取物对高脂血症小鼠血液、肝脏产生的影响。

证明了连翘提取液可降低高脂血症小鼠血清中胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白水平升高高密度，在一定程度上能够改善高脂血症小鼠血脂紊乱现象，对小鼠肝脏也具备保护作用。

王新等［9］的甲氧苄啶与连翘联合应用的抗菌试验，证明了连翘与甲氧苄啶联用对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌效果呈协同作用，对沙门氏菌的抗菌效果呈相加作用。

此外，相关报道连翘提取物三萜类化合物ＤＭ可以引起人低分化胃癌细胞凋亡，有放疗增敏作用。

连翘提取物对多种肿瘤细胞具有明显的抑制作用，连翘中的连翘脂素和表松脂素对人胃癌细胞株SGC7901生长也有一定的抑制作用。

连翘叶醇提物和水提取物均能通过清除活性氧自由基及提高抗氧化酶活力来保护线粒体，具有一定的抗氧化及抗衰老的药用价值。

1.2 类黄酮
1.2.1 类黄酮的结构和分类
类黄酮（又被称为黄酮类化合物），是一种具有多种颜色广泛存在自然界的化合物。

目前，黄酮类化合物泛指两个芳香环，通过三碳链互相连接而成的一系列化合物，其基本骨架如图1、图2：
天然黄酮多为上述基本母体的衍生物，迄今为止，世界上发现的黄酮类化合物已经超过5000多种[10~12]。

1.2.2 类黄酮的来源
类黄酮的来源非常的广泛，除了存在于自然界中的水藻，金鱼藻外，黄酮类化合物都是绿色植物特有的产物，这种化合物几乎遍布于植物体的各个部分，如叶、根、木质部、树皮、花中。

1.2.3 类黄酮的提取
1.2.3.1 溶剂提取
人们通常采用水和有机溶剂对黄酮类化合物进行提取。

在采用水做为提取溶剂时，由于黄酮类化合物在水中溶解度较低，通常会对提取溶液加热或者加碱来提高化合物在水中的溶解度。

但是加碱时浓度过高，会造成黄酮类化合物在强碱条件下造成结构破坏。

水提法黄酮提取率较低，易把提取原料中易溶于水的内容物提取出来，因为其中富含糖类和蛋白质，所以提取液存放易腐败变质。

用有机溶剂提取，可克服水提法的产生的问题，是一种最为常用的提取方法。

杨洋等一睡集不同有机容积对柚子皮黄酮类化合物尽兴了提取方法的比较研究，结果表明以70%乙醇提取效果最好。

但也在于提取所用的成本过高的问题。

1.2.3.2 超声波辅助提取
超声波辐射压强产生的震动效应、空化效应和热效应可以加速植物物质膨胀和水化，并以扩散和传递的方法使可溶性物质向溶剂中传送，在相当程度上极大地提高提取效率。

超声空化产生的极大的压力能够使细胞壁和膜类物质瞬间破碎，并引起湍动效应、微扰效应、界面效应和聚能效应，使传质边界层变的薄弱，导致界面层中的浓度梯度逐渐减少，增大传质速率，且微扰效应强化了类黄酮的微孔扩散，聚能效应和热效应加快了类黄酮分子扰动，从而整体上提高提取过程的传质速率和效果，缩短提取时间[13,14]。

兰云昌等进行了超声波法提取槐花中黄酮的最佳工艺研究，结果表明在乙醇浓度为60%，75℃，料液比1：5条件下提取30min，连续提取2次，得到黄酮类化合物提取率可高达99.84%。

赵永光等用超声波辅助提取法对侧柏片中类黄酮物质尽兴研究，结果表明，在先以50%乙醇wield溶剂浸泡20 h，然后在70℃，超声波40KHz，超声处理40min条件下，总黄酮的提取率可达到93.6%，
与传统醇提法相比，提取率高了23.43%，而且该方法节省时间、操作简便、快捷、节约能源，显示除了该提取方法的一定的优越性[13-14]。

1.2.3.3 酶法提取
在生物技术不断飞速发展的今天，酶法提取已经逐渐被广泛应用于有效成分的提取中，酶法提取主要通过不同种类的酶来破坏细胞壁或膜的结构。

酶法提取具有反应条件温和、选择性高、专一性高的特点。

此外，酶法提取还具有提取率高、成本低、简化后续分离纯化工作，底物不易被破坏，能够有效优化组分，提高目标产物药用价值。

陈炳华等通过将山楂中的果胶分解成小分子，依靠酶解法对山楂黄酮类化合物提取及含量分析的影响进行了研究，其结果充分表明该实验结果提取率比目前普遍使用的方法提高了2~3倍[15]。

1.2.3.4 超临界流体萃取技术
超临界流体萃取技术是一种在临界温度和压力的条件下，以超临界流体为萃取溶剂，对目标产物进行有效成分的分离提取的方法。

曾启华等研究了超临界萃取的压力、温度、夹带剂等因素条件对对银杏叶类黄酮化合物的萃取效率的影响，得到了银杏叶黄酮类化合物提取最优条件：压力20Mpa，温度为40℃，夹带剂用量为10mL/g乙醇。

邓丹雯等进行了超临界萃取藜蒿中类黄酮无知的研究，相关研究表明：以1.5mL/g无水乙醇为夹带剂，在35℃，30Mpa条件下提取为最佳条件[16-17]。

超临界萃取作为一项新兴技术，在用于类黄酮的提取时，因为二氧化碳的非极性和类黄酮的极性，萃取所需条件要求高，设备成本大，故目前将其工业化生产上有一定的难度。

1.2.3.5 微波法连翘叶类黄酮的提取
近些年来，微波技术因为其反映的高效、高选择性、操作简便副产物少、产率高以及下游加工过程简单等优点[18]，在生化蛋白质水解、有机合成、酯化反应等方面被广泛应用。

目前有文献报道用于天然产物的提纯[19]。

本文探索运用微波技术提取连翘叶中的类黄酮，为连翘叶的充分理由提供新方法，并将其应用到食用豆腐的防腐实验中。

1.2.4 类黄酮对细菌的抑制
类黄酮具有广谱抗菌的特点，黄酮类化合物可通过可通过破坏细胞壁及细胞膜的完整性，影响微生物内膜电子传递、营养吸收、核苷酸合成及ATP 活性等功能，进而制病原微生物的生长。

殷彩霞等人[20]指出，类黄酮及其衍生物一般呈弱酸性（pH 值为6），其衍生物因其能使蛋白质凝固或变性而有杀菌和抑菌的效果。

韩淑琴等人[21]通过透射电镜观察，仙人掌醇提物随着时间的延长，对微生物的菌体结构造成破坏，使菌体扭曲变形，进而细胞壁破裂，内容物外漏，直至成为空壳或分解为颗粒状残渣；聚丙烯酰胺凝胶电泳显示，仙人掌提取物作用使菌体内蛋白质减少，对大分子蛋白质有破坏或抑制其合成的作用。

本文将对黄酮类化合物抑菌性能进行研究，探求连翘提取物单剂及复配剂对两种草莓采后病原菌的抑制作用。

1.3 常用检测方法
1.3.1 紫外-可见分光光度法
紫外可见分光光度法的原理是类黄酮化合物与铝离子形成有色、稳定的并具有特征吸收光谱的络合物［22］。

该方法特异性差，测定结果一般是总黄酮含量。

贾春晓［23］以槲皮素甲醇溶液为标准溶液，乙酸乙酸钾为缓冲液，利用272nm吸光度值测定银杏叶提取物中总黄酮含量。

金雀异黄素标准品和大豆样品均在259nm处有最大吸收峰，且干扰较少。

因此，可以金雀异黄素为标准品，在259nm波长下测定大豆总异黄酮含量［24］。

Abrosca等［25］在350nm波长下，以槲皮素为标准物质测定苹果总黄酮含量，结果表明：苹果皮总黄酮含量远远高于果肉［26－28］。

孙丽萍等［29］以芦丁为标准物质，在360nm波长下，对聚酰胺-UV法、比色法和双波长法进行了比较，确定聚酰胺-UV法是一种比较理想的蜂花粉总黄酮含量检测方法。

1.3.2 高效液相色谱法（HPLC）
高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。

该方法通过液体流动相和高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、
缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱。

当各组分分离时，将式样送入检测器检测分析。

高效液相色谱法有高压、高速、高效、高灵敏度和应用范围以及色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收等优点，更易于后期加工制备纯样。

对于沸点高、热稳定性差、不易气化以及具有生理活性物容易分析。

该法既可直接分析黄酮苷含量，也可通过分析水解后苷元的含量来测定总含量。

第二章实验材料及装置仪器
2.1 实验材料
2.1.1 原料预处理
实验采用沈阳化工大学7月采集连翘叶，采集后放于通风阴凉处晾干，粉碎过筛，阴凉处保存备用；防腐实验所用材料为沈阳化工大学超市购买的新鲜豆腐。

2.1.2 实验药品
实验所需主要药品见表1。

表1 实验药品
药品名称纯度生产厂家
硝酸铝分析纯天津市福晨化学试剂厂
氢氧化钠分析纯西陇化工股份有限公司
亚硝酸钠分析纯天津市福晨化学试剂厂
无水乙醇分析纯天津市富宇精细化工有限公司2.2 实验仪器与设备
实验所用主要仪器与设备见表2。

仪器名称仪器型号仪器厂家
电子天平FA-1004 上海精科天平厂
型数超声波清洗器KQ5200DE 曙峰企业制造低速离心机LD4-2 北京医用离心机厂
高速万能粉碎机FW100 天津市泰斯特仪器有限公司电热恒温鼓风干燥箱DHG-9240A 上海精宏实验设备有限公司
紫外∕可见分光光度计
格兰仕微波炉
自动电位滴定仪
超净工作台
UV1100
G80F20CN2L-B8(S0)
ZDJ-4A
SW-CJ-1FD
上海天美科学仪器有限公司
佛山市顺德区格兰仕微波炉电器有
限公司
上海仪电
苏州安泰空气技术
2.3 实验方案
2.3.1 方案确定
本实验选用蒸馏水作为提取溶剂，采用微波法对连翘叶中总黄酮进行提取。

进行单因素实验并优化，将提取的溶液用于豆腐防腐的研究。

2.3.2 配制芦丁标准溶液制定工作曲线回归方程
用电子天平准确称取3.0mg干燥至恒重的芦丁标准品，溶解于30%乙醇溶液中，用50ml容量瓶定容，作为芦丁标准液。

然后精密量取芦丁标准液2.00ml，4.00ml，6.00ml，8.00ml，10.00ml，置于试管中，加30%乙醇溶液补足至10.00ml，加5%亚硝酸钠溶液0.75ml，摇匀，静置5min，再加10%硝酸铝溶液0.75ml，摇匀，静置5min，再加入4%氢氧化钠溶液6.00ml摇匀，静置5min，各管再用30%乙醇溶液稀释至20ml，摇匀，静置10min，测定510nm波长处吸光度值，同时做四组平行实验。

另取
10.00ml30%乙醇溶液，加同量5%亚硝酸钠溶液，10%硝酸铝溶液，4%氢氧化钠溶液，同法操作，也用30%乙醇稀释至20ml作为空白对照。

以浓度为横坐标，510nm吸光度为纵坐标绘制芦丁标准曲线。

以进一步计算黄酮得率。

计算方法如下：
设提取液中黄酮类化合物提取率为x，稀释以后的浓度为c，原提取液浓度为c0则有黄酮含量计算公式如下：
x=c0*100ml*100％/（1.0g*1000）其中c0=c*40 由标准曲线计算出正交优化条件下杜仲叶黄酮提取液中黄酮类化合物的含量，黄酮类化合物提取率。

2.3.3 类黄酮的提取与测定
2.3.3.1 类黄酮的提取工艺流程
将连翘叶烘干→研碎→微波辅助水提→离心→取上清液（定容到100mL）
2.3.3.2 类黄酮的测定
实验利用硝酸铝显色法，通过分光光度法测定510nm波长处吸光度值作为进行黄酮的定量比较的指标。

方法步骤如下：第一步：提取液过滤，取滤液0.5ml，加入30%乙醇溶液9.5ml，对照组不加滤液，第二步:加30%乙醇溶液10ml；加入5%亚硝酸钠溶液0.75ml，混匀，静置5min；第三步：加入10%硝酸铝溶液0.75ml，混匀，静置5min；第四步：加入4%氢氧化钠溶液6ml，混匀，静置5min；再加入30%乙醇溶液2.5ml，混匀，静置10min，测定510nm两波长处吸光度值，每组测四次，再求取平均值。

2.3.4 微波水提法单因素实验
2.3.4.1 微波时间
分别称取1g连翘叶粉末4份，料液比都为1：20，微波功率为480W。

以时间作为变量，即1min、1.5min、2min、2.5min、3min提取两次，同时做四组平行实验。

提取液定分别容至100ml,提取液按照上述硝酸铝检测法进行检测实验。

2.3.4.2 料液比
分别称取1g连翘叶粉末4份，微波功率为480W，处理时间为2min料液比作为变量，即1：10、1：15、1：20、1：25、1：30。

提取两次，同时做四组平行实验。

提取液分别定容至100ml，提取液按照上述硝酸铝检测法进行检测实验。

2.3.4.3 微波功率
分别称取1g连翘叶粉末4份，料液比为1：20，微波处理时间为2min，以微波功率作为变量即160W、320W、480W、640W、800W.。

提取两次，同时做四组平行实验。

提取液定分别容至100ml，提取液按照上述硝酸铝检测法进行检测实验。

2.3.4.4 提取次数
分别称取1g连翘叶粉末4份，料液比为1：20，微波功率为480W，处理时间为2min，以提取次数为变量即1次、2次、3次、4次、5次。

同时做四组平行实验。

提取液定分别容至100ml,提取液按照上述硝酸铝检测法进行检测实。

2.3.4.5 微波水提法正交实验
通过单因素实验分析得出，料液比，提取时间，提取功率，提取次数为影响连翘花黄酮提取率的主要因素，评判指标为总黄酮提取率，采用L9（34）正交表进行实验优选方案设计，其因素水平表见表3。

表3 因素水平设计表
因素
水平
A料液比B提取时间/(min) C微波功率/W D提取次数
1 1:17 1.7 480 1
2 1:20 2.0 560 2
3 1:23 2.3 640 3
2.3.5 连翘叶提取物对豆腐的保鲜作用研究
2.3.5.1 豆腐防腐试实验步骤
将购买的新鲜豆腐切成2cm×2cm×1cm小块，用浓缩的连翘叶提取物配制成浓度为0.1g/ml、0.05g/ml、0.025g/ml、0.0125g/ml、0.00625g/ml的系列溶液[30]，每份50ml，把切好的豆腐坊在配置完成的溶液中浸泡3min，取出沥干豆腐表面水分放在灭菌后的平板内，30℃恒温培养箱培养，空白对照组以无菌水浸泡，每个浓度梯度做两组平行试验。

2.3.5.2 连翘提取物与壳聚糖联合防腐实验步骤
将购买豆腐按2.3.5.1步骤切块，将连翘叶提取物和3%柠檬酸溶解的壳聚糖按1：1比例混合，配制成含连翘叶提取物浓度为0.1g/ml、0.05g/ml的混合液（壳聚糖和连翘叶提取液浓度按照最佳抑菌效果选择），每份50ml，把切好的豆腐坊在配置完成的溶液中浸泡3min，取出沥干豆腐表面水分放在灭菌后的平板内，30℃恒温培养箱培养，以无菌水和壳聚糖单独浸泡的豆腐作为对照，每个浓度梯度做两组平行试验。

2.3.5.3 豆腐质量评价测定方法
可以通过观察、口感、嗅觉等感官辨别豆腐质地是否变软，气味及其颜色是否异常对其进行定性分析；每隔24h观察一次，统计腐坏最严重的一面霉斑数，测量直径，按霉斑其直径大小分为5个等级：直径＜1mm是一级霉斑；1-2mm的是二级霉斑；2-4mm的是三级霉斑；4-6mm的是四级霉斑；＞6mm的是五级霉斑；并按下面的公式来计算豆腐受病指数：
病情指数（k）=∑(各级霉斑数×各级级别) /M[31]（1），其中M=（观察样块面积/5级霉斑面积）×最高级别[31]（2）
pH值用PH试纸测量。