布洛芬对少突神经胶质细胞生长发育的影响

布洛芬对少突神经胶质细胞生长发育的影响
江继鹏;杨凯;赵飞;张珊珊;逄瑷博;张赛;陈旭义
【摘要】目的探究布洛芬对少突胶质细胞(OLs)生长发育的影响.方法健康清洁级SD成年大鼠6只,提取OLs,扩增后加入溶血磷脂酸(LPA)观察细胞形态变化.使用出生24~48 h的新生鼠6只,提取少突胶质细胞前体细胞(OPCs),将OPCs接种后随机分为对照组、LPA组、布洛芬组、LPA+布洛芬组.贴壁3 d后观察细胞形态,对照组加入生理盐水,其他3组分别加入LPA(1.0 μmol/L)、布洛芬盐水溶液(100 μmol/L)及两者的混合液.药物持续干预7 d后观察细胞形态,分别对OPCs特异性免疫标志物血小板源生长因子受体α(PDGFR-α)和OLs特异性免疫标志物髓鞘碱性蛋白(MBP)行免疫荧光染色观察OPCs及OLs形态并细胞计数.使用Western blot法比较各组MBP相对表达量.结果 LPA作用于成熟OLs后细胞突起减
少.OPCs贴壁3 d时各组细胞发育良好.药物干预7 d后,布洛芬组和LPA+布洛芬组中细胞突起明显多于对照组和LPA组.布洛芬组、LPA+布洛芬组的MBP阳性细胞计数多于对照组和LPA组(P<0.01).Western blot结果显示,LPA组的MBP表达量明显少于其他3组(P<0.01),布洛芬组表达量明显多于LPA+布洛芬组
(P<0.01).结论 LPA对OPCs的生长发育有毒性作用,对成熟OLs的正常生长具有抑制作用,一定浓度的布洛芬能够显著抑制LPA对OPCs及OLs的细胞毒性作用.%Objective To study the effects of ibuprofen on the growth and development of oligodendrocytes. Methods A total of 6 clean and healthy adult female SD (Sprague Dawley) rats were used for extracting and culturing of oligodendrocytes(OLs).Lysophosphatidic acid(LPA)was then added,and the morphological changes of OLs pre-treatment and post-treatment were observed. Then 6 newborn rats (born 24-48 h) were used
for mixed glial cell extraction from the cortex, then the OPCs were inoculated into the culture plates and randomly divided into control group, ibuprofen group, lysophosphatidic acid(LPA)group and LPA+ibuprofen group.After the adhering of the cells in each group for three days, cell morphology was observed,and the drugs were added as interventions.The control group was treated with normal saline, and the other 3 groups were added with saline solution of ibuprofen(100 μmol/L),LPA(1.0 μmol/L)and the mixture of them. The cell morphological changes were observed after 7-day intervention.The morphology of OPCs and OLs were observed by immunofluorescence staining through OPCs'specific immune markers (platelet-derived growth factor receptor alpha, PDGFR-α)and OLs'specific immune markers(myelin basic protein,MBP)along with cell count of mature OLs.Western blot assay was used to detect the relative expression level of MBP in each group. Results After the treatment with LPA to the mature OLs,protrusions were shrinking and became very sparse.The morphology of cells developed well in each group after cell adhering for 3 days. After drug intervention for 7 days, more cell protrusions and branches were observed in ibuprofen group and LPA+ibuprofen group than those of the control group and LPA group.The results of cell count showed that the number of MBP positive cells was significantly higher in the ibuprofen group and LPA+ibuprofen group than that in the control group and LPA group(P<0.01).The results of Western blot assay showed that the MBP protein expression was significantly less in LPA group than the other three groups (P<0.01), and the expression was significantly higher in the
ibuprofen group than that of LPA+ibuprofen group (P<0.01). Conclusion LPA has a toxic effect on the growth and development of OPCs, and it has an inhibitory effect on the normal growth of mature OLs. A certain concentration of ibuprofen can significantly inhibit the cytotoxicity of LPA on OPCs and OLs,and promote the formation and maintenance of mature OLs.
【期刊名称】《天津医药》
【年(卷),期】2018(046)005
【总页数】6页(P509-514)
【关键词】布洛芬;少突神经胶质;溶血磷脂素类;受体,血小板源生长因子;髓磷脂碱性蛋白质类;生长发育
【作者】江继鹏;杨凯;赵飞;张珊珊;逄瑷博;张赛;陈旭义
【作者单位】天津,武警后勤学院附属医院脑科中心,武警部队脑创伤与神经疾病研究所,天津市神经创伤修复重点实验室 300162;南京市第二人民医院;锦州医科大学研究生院;武警后勤学院救援医学系生药与药剂教研室;武警后勤学院学员二旅;天津,武警后勤学院附属医院脑科中心,武警部队脑创伤与神经疾病研究所,天津市神经创伤修复重点实验室 300162;天津,武警后勤学院附属医院脑科中心,武警部队脑创伤与神经疾病研究所,天津市神经创伤修复重点实验室 300162
【正文语种】中文
【中图分类】R349.5
少突胶质细胞（oligodendrocytes，OLs）是中枢神经系统中一类重要的支持细胞，在轴突包绕、髓鞘绝缘结构形成、协助兴奋传递、维持保护神经元正常代谢等方面发挥决定性的作用［1-2］。

OLs功能不良或发生病变时，可能发生严重的脱髓鞘疾病，其中以多发性硬化症（MS）为代表的中枢神经系统脱髓鞘疾病已经成为困扰人类健康的一类顽疾［3］，其发病的年轻化、病情的反复性、治疗策略的单一性及预后的不确定性给患者及其家庭带来极大的痛苦［4］。

目前该类疾病的发病机制仍未完全阐明，相关治疗进展依旧缓慢，临床诊疗主要以控制急性发作、延缓疾病加重、促进中枢神经系统中神经元轴突再生及髓鞘化为主要思路，常用的药物如糖皮质激素、免疫抑制剂等的不良反应是传统疗法存在争议的一大原因［5］，而新兴的治疗策略如干细胞疗法等仍存在较多的不确定性。

因此，寻找新的、安全有效的替代药物保护内源性的、幼稚的少突胶质细胞前体细胞（oligodendroglial precursor cells，OPCs）及成熟的OLs是目前治疗脱髓鞘疾病的一个新课题。

布洛芬作为一种非甾体抗炎药已被广泛应用于临床镇痛治疗。

近年来研究显示，布洛芬可通过抑制环氧化酶等途径控制出血性脑卒中后神经系统炎症反应及少突胶质细胞祖细胞的死亡，减少脑白质损伤，促进早期髓鞘的形成［6］。

本文主要研究布洛芬对OPCs的促成熟作用及对OPCs和OLs的保护作用，旨在为下一步脱髓鞘疾病的基础研究和临床治疗提供更多的可能。

1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物清洁级健康成年雌性SD大鼠6只，体质量200～250 g；新生SD大鼠（出生24～48 h）6只，均购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心。

1.1.2 主要药品及试剂布洛芬、油脂酰溶血磷脂酸（北京阿拉丁公司），DMEM/F12型培养基（美国HyClone公司），兔抗大鼠血小板衍生生长因子受体-α抗体（PDGFR-α，美国SCB公司），羊抗大鼠髓鞘碱性蛋白抗体（MBP，美国Abcam公司）。

1.1.3 主要仪器和设备细胞恒温培养箱DNP-9082（美国耐普克公司），高温高压蒸汽灭菌锅MLS-3750L-PC（日本Sanyo公司），相差倒置荧光显微镜
CKX41-A22PHP（日本奥林巴斯公司），显微手术器械（苏州施强公司），手术解剖显微镜M844F40（瑞士徕卡公司），微量电子称TP-202（贵州电子衡器公司），高速细胞离心机5702R（德国Eppendorf公司）。

1.2 方法
1.2.1 细胞获取及分组干预对6只成年SD大鼠提取OLs进行培养扩增，并对6只新生大鼠提取脑皮质获取混合胶质细胞，经分离、扩增，传代获得一定数量的OPCs，分别对获取的OLs和OPCs进行免疫荧光染色。

用溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid，LPA）干预成年SD大鼠的OLs，并观察干预前后OLs形态学变化。

将OPCs接种于24个六孔细胞培养板中，按随机数字表法随机分为对照组、布洛芬组、LPA组及LPA+布洛芬组，每组6个培养板。

待各组细胞贴壁第3天，观察细胞形态并加入药物干预，对照组加入生理盐水，其他3组分别加入布洛芬盐水溶液（100µm ol/L）、LPA（1µmol/L）及两者的混合液各1 mL。

药物干预持续7 d后进行细胞形态观察，比较各组OLs生成情况并进行成熟OLs细胞计数。

1.2.2 OPCs及OLs的免疫荧光染色鉴别吸管吸取细胞培养基，PBS清洗细胞层3次，应用4%多聚甲醛1 mL固定细胞30 min，每个孔再次用PBS液清洗3次，使用聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）浸没培养皿10 min后用PBS清洗3次，吸取1 mL BSA封闭液封闭细胞膜表面15 min后分别加入PDGFR-α
（1∶200）和MBP（1∶200）一抗37～40 ℃下反应30 min，4℃下孵育过夜后吸取多余一抗，PBS冲洗3次，分别加入荧光二抗（鼠抗兔和鼠抗羊IgG荧光抗体），37℃下放置1 h，缓冲液摇洗3次（60 r/min），滤纸吸干盖玻片，加入DAPI（1∶100）静置10 min。

然后利用缓冲液摇洗3次，3～5 min/次。

封片后在相差倒置荧光显微镜下（200倍）观察PDGFR-α、MBP荧光染色情况。

1.2.3 LPA干预前后OLs形态学观察用光学显微镜（400倍）观察获取的大鼠成
熟OLs的细胞形态，在OLs培养皿中加入1 mL LPA（1.0µmol），2 h后观察细胞形态的改变，进行干预前后的比较。

1.2.4 药物干预前后各组OPCs的形态学观察将获取的新生鼠的OPCs扩增培养后以6.7×104/cm2接种于六孔细胞培养板中，细胞贴壁3 d后在光镜下（200倍）观察各组细胞形态，分别对各组进行相对应的药物干预，持续7 d后，光镜下（200倍）观察细胞形态，进行干预前后的比较。

1.2.5 免疫荧光染色观察及细胞计数持续干预7 d后，进行MBP免疫荧光染色（染色过程重复1.2.2中的操作步骤），观察各组OPCs的生长发育情况和MBP
阳性细胞数量，每组随机取20个孔。

应用Image Pro Plus图像分析系统进行细
胞计数。

1.2.6 Western blot法检测MBP的表达药物持续干预7 d后，取细胞培养液以
10 000 r/min离心10 min，取上清分装。

用BCA蛋白含量检测试剂盒检测蛋白
浓度，调节蛋白终浓度为3 g/L，-80℃保存。

每组按30µg/孔上样，行12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），将电泳仪电压调至80 V，待溴酚蓝指示剂进入分离胶后调整指示电压至110 V，湿法将蛋白转至硝酸纤维素膜上，5%牛血清白蛋白封闭，加入一抗（羊抗大鼠MBP抗体1∶10 000和兔抗大鼠GAPDH抗体1∶10 000）室温孵育1 h，4 ℃过夜，二抗（HRP-兔抗羊1∶2 000和HRP-羊抗兔1∶20 000）室温孵育1 h，用TBST在震荡器上洗3次，每
次10 min，ECL化学发光显色试剂盒曝光显影，凝胶成像仪获取图像，使用Scion Image软件分析计算相对灰度值。

1.3 统计学方法采用SPSS 2
2.0统计软件进行统计学分析。

数据以±s表示，采用析因设计进行单个因素主效应及双因素交互效应统计分析。

P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 OPCs及OLs的免疫荧光染色结果免疫荧光染色后PDGFR-α阳性的OPCs 胞质呈红色，胞核呈蓝色；MBP阳性的OLs胞质和突起呈绿色，胞核呈蓝色。

见图1。

Fig.1 Immunofluorescencestainingof OPCsand OLs(×200)图1 OPCs及OLs 免疫荧光染色（×200）A：PDGFR-α阳性的OPCs；B：MBP阳性的OLs
2.2 LPA干预前后OLs的形态比较 LPA作用于成熟OLs后可见呈“蜘蛛网状”生长的突起自末端向胞体方向萎缩，细胞间致密的网状连接变得十分稀疏。

见图2。

Fig.2 Morphological comparison of OLsbefore and after LPA
treatment(×400)图2 LPA干预前后OLs的形态比较（×400）A：LPA干预前；B：LPA干预后（箭头显示细胞突起的变化）
2.3 药物干预前后各组OPCs细胞的形态学变化各组在OPCs贴壁3 d时光镜下可见细胞形态多呈类圆形，胞体折光性较强。

药物干预7 d后，对照组中大部分细胞在7 d时形态呈两极化生长，细胞突起少，无网状连接形成。

LPA组细胞突起变细、萎缩，胞体生长不良，折光性下降。

布洛芬组和LPA+布洛芬组较LPA 组细胞突起及分支明显增多，分支间形成网络连接，发育良好。

见图3。

Fig.3 Comparison of growth and development of cellsbeforeand after treatment(×200)图3 各组干预前后细胞的生长发育状况比较（×200）A～D分别为对照组、LPA组、布洛芬组和LPA＋布洛芬组干预前；E～H分别为对照组、
LPA组、布洛芬组和LPA＋布洛芬组干预后
2.4 药物干预后各组OPCs细胞的免疫荧光染色比较结果显示，布洛芬对细胞成熟发育有积极作用，加了LPA后细胞发育明显受到抑制，但当LPA和布洛芬同时添加时，LPA对细胞的抑制作用得到了明显控制，表现为布洛芬组和LPA+布洛芬组细胞突起明显多于对照组和LPA组，且对照组细胞突起明显多于LPA组，见图4。

布洛芬组和LPA+布洛芬组MBP阳性细胞数（OLs）明显多于对照组和LPA 组，而后2组差异无统计学意义，见图5。

Fig.4 Comparison of immunofluorescencestainingafter treatment between four groups(×100)图4 各组干预后免疫荧光染色比较（×100）A：对照组；B：LPA组；C：布洛芬组；D：LPA＋布洛芬组
Fig.5 Comparison of thenumber of OLsbetween four groups图5 各组OLs 数目比较F LPA=24.684，P＜0.01；F布洛芬=952.068，P＜0.01；F交互
=4.940，P＜0.05
2.5 MBP表达的Western blot检测结果显示，LPA组的MBP相对表达量明显低于其他3组，布洛芬组MBP相对表达量高于LPA＋布洛芬组，见图6。

3 讨论
Fig.6 Comparison of MBPexpression levelsbetween four groupsby Western blot assay图6 Western blot法比较各组MBP相对表达量F LPA=304.315、F 布洛芬=1 507.392、F交互=27.294，均P＜0.01
3.1 中枢性脱髓鞘疾病的研究现状中枢性脱髓鞘疾病的高发病率和年轻化已使其成为影响人类健康的一大因素。

尤其在欧美，MS是年轻人中除外伤外导致神经障碍最常见的疾病，是增加年轻人死亡率的一大因素［7］。

急性中枢性脱髓鞘病变的髓鞘在短期内可能再生，然而慢性、复发性或者进展性髓鞘病变的再生相对比较困难，且极易遗留神经功能缺损症状。

目前针对以MS为代表的自身免疫性脱髓
鞘疾病的治疗尚无有效的根治药物，髓鞘再生涉及OLs发生及成熟过程中多种精细协调机制，而相关机制虽有所进展但仍有不足［8］。

因此诱导内源性髓鞘再生已成为该领域的一个研究热点。

OLs在神经发生脱髓鞘病变时，可向病变部位迁移、增殖并替代围绕神经轴突周围已变性的无功能髓鞘组织［9］。

而OLs的再生能力依赖OPCs的增殖分化。

因此针对OLs分化发育成熟机制的研究有助于临床良性干预髓鞘的再生修复。

3.2 布洛芬对OLs的保护作用布洛芬应用于临床已有很多年。

近些年来其在经典抗炎镇痛作用外的神经保护研究也越来越多。

体外研究证实布洛芬可在一定程度上减小成熟OLs的凋亡程度［10］，提示布洛芬有一定的神经保护作用。

同时，布洛芬也已被应用于阿尔兹海默病的治疗［11］。

目前已知多种信号通路均参与OLs的分化发育成熟，如Rho/Rock信号通路、Wnt/β-catenin信号通路、Shh 信号通路、BMP信号通路等［12］，其中Rho家族中的鸟苷三磷酸（GTP）酶在调节细胞形态中具有重要作用［13-14］。

有研究指出布洛芬可通过作用于神经系统中的多种细胞，如星形胶质细胞、小胶质细胞和神经元细胞内的RhoA信号通路影响细胞形态结构变化［15］。

尤其在OPCs发育为成熟OLs过程中，Rho信号通路的关键酶RhoA酶的活性状态呈逐渐降低的趋势［16］。

有研究提示通过抑制RhoA酶活性可以促进少突胶质细胞突起生长［17］。

本实验的设计阶段，除了进行盐水对照组的设置以外，还加入了RhoA激酶激活剂LPA［18］，选择的LPA浓度为1.0 µmol/L，有相关文献证实在该浓度下少突胶质细胞胞体增大，突起明显减少［19］。

此外，本实验中使用的布洛芬浓度为100µmol/L。

Roloff 等［10］证实在此浓度下神经突即可发生明显的伸长。

LPA作用于大鼠OLs 2 h 后即出现了细胞突起自末端向胞体方向萎缩，胞间的网状连接变稀疏的现象，揭示了LPA对于成熟OLs的毒性作用，证实Rho信号通路保持低活性对于维持成熟OLs完整结构形态可能具有重要意义［20］。

此外，设计的4个组中，在细胞贴
壁3 d后开始进行药物干预，因为在这个时间点细胞贴壁基本已经完成，开始进入形成突起的关键阶段［21］，在持续7 d干预后，布洛芬组和LPA+布洛芬组中细胞分化发育明显好于对照组和LPA组，且免疫荧光染色和Western blot结果均显示布洛芬组中OLs增殖发育好于LPA+布洛芬组，证明了布洛芬可在一定程度上削弱了LPA对OPCs的毒性作用，且能够促进OPCs向OLs成熟形态发育并维持其正常状态。

3.3 不足与展望本实验在布洛芬对OPCs的生长发育及OLs的形态维持方面进行了相关探索，但由于OPCs生长分化发育受到多种复杂的细胞内外因素的影响［22］，且本实验思路相对简单，尚不具备更好的临床指导作用，在未来的研究中还有待进一步探究布洛芬应用的最佳时间窗及最佳剂量，并逐步拓展到其他神经系统疾病治疗研究中，为神经保护和疾病治疗提供更多的策略。

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