木质素抗氧化性的研究及应用

木质素抗氧化性的研究及应用
曹巍瀚，牛云①，罗岗，李柯，王楠，史瑞欣②
（黑龙江省•东北林业大学，黑龙江哈尔滨150040）
摘要：采用DPPH法对浓度范围为50~500μg/m L七组浓度下的木质素磺酸钠水溶液和浓度范围为50~300μg/m L六组浓度下的碱木质素水溶液的抗氧化性进行了研究，绘制了两种木质素与DPPH的反应动力学曲线。

研究结果表明：浓度为400μg/mL的木质素磺酸钠与其他浓度的木质素磺酸钠水溶液相比，对DPPH清除能力最强，反应终止时，对DPPH的清除率达97.4%；浓度为200μg/mL和250μg/mL的碱木质素对DPPH的清除能力相当，且高于其他浓度，反应终止时，对DPPH的清除率分别为93.9%和94.6%。

关键词：木质素；抗氧化性；DPPH
Abstract: The antioxidant activity of two kinds of lignins, sodium ligninsulfonate and alkali lignin were studied. The kinetics of radical scavenging of lignin was determined using spectrophotometric method by means of scavenging of the free radical 2,2-diphenyl- 1-picrylhydrazyl (DPPH). Seven groups of different concentrations in the scope from 50 to 500μg/m L of sodium ligninsulfonate aqueous and six groups of different concentrations in the scope from 50 to 300μg/m L of alkali lignin aqueous were studied. The results show that as to the sodium ligninsulfonate, the radical scavenging capacity of 400μg/mL sodium ligninsulfonate aqueous is the highest and the scavenging rate of it is 97.4%. As to the alkali lignin, 200μg/mL and 250μg/mL of alkali lignin aqueous show the similar radical scavenging capacity, which is higher than other groups, the scavenging rates of them are 93.9% and 94.6% respectively.
Keywords: lignin, antioxidant, DPPH
近年来，对于木质素的各方面研究已经在如火如荼的进行中，木质素的抗氧化性的研究也有着很大的空间。

在国外西班牙的科学家M P维纳德尔，V阿伽侗杜，M米特詹斯对来源于甘蔗、木质素磺酸盐和橘子等工业用木质素局部施用可能引起的眼刺激和皮肤刺激进行了探讨，针对木质素的高抗氧化性研究，以及相应的对眼和皮肤的安全性研究，为木质素在化妆品配方中的应用开拓了新的方向[1]。

在国内上海复旦大学张莹、雷中方首次探索了在造纸黑液中利用酸化—抽滤法提取木质素过程中不同提取条件对木质素抗氧化性的影响[2]。

木质素广泛存在于造纸黑液中，如不加以利用，对于环境的污染是巨大的，同时也是对这一宝贵资源的巨大浪费[2]。

从对木质素的抗氧化性的研究中，可以探索一种对于人体无毒无害的抗氧化活性物质，在化妆品行业以及其他工业有很好的应用前景[3]。

用DPPH法测定生物试样、分类物质和食品的抗氧化能力已经被广泛的应用[4~6]。

此法是根据DPPH自由基有单电子，在517nm处有一强吸收，当有自由基存在时，由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其接受的电子数量成定量关系，因而可用分光光度计进行快速的定量分析，本文应用此方法对碱木质素与木质素磺酸钠的抗氧化性进行了研究。

基金项目：东北林业大学院校共建大学生创新训练项目
作者简介：曹巍瀚（1990—），男，东北林业大学本科生
1.实验部分
1.1 仪器和试剂
TU-1800紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；FTIR-7600傅里叶红外光谱仪（KBr压片）；碱木质素（从sigma公司购买）、木质素磺酸钠（市售工业纯）、DPPH与1,4-二氧六环均为分析纯试剂。

1.2 实验部分
1.2.1 木质素溶液的配制精确称取一定质量的碱木质素和木质素磺酸钠各一份，碱木质素用比例为7:3的1,4-二氧六环和蒸馏水的混合液配制浓度为500μg/ml的溶液，木质素磺酸钠用蒸馏水配制成与碱木质素等浓度的溶液。

1.2.2 DPPH溶液的配制准确称取质量为0.0591 g的DPPH，用比例为7:3的1,4-二氧六环与水的混合液配制浓度为600μg/ml的溶液备用。

1.2.3 DPPH标准曲线的绘制用配好的600μg/ml DPPH母液配制浓度（μmol·L-1）分别为60、120、150、180、240、270、300、360、480、600共10个浓度的DPPH标准品溶液，以相应空白溶剂为参比液，于517nm处测定吸光度。

以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，求出线性回归方程，并得到线性相关系数R2。

1.2.4木质素与DPPH反应动力学研究用配好的两种木质素母液分别配制浓度为50、100、150、200、250、300μg/ml的木质素样品溶液，考察不同浓度下的木质素溶液对DPPH·的反应动力学。

将0.3ml木质素溶液与2.7ml DPPH·溶液混合后，立即在517nm下测吸光值（A i），以相应的空白溶剂为参比，0～5 min隔30 s测定1次，5～10 min隔60 s 测定1次，10～30 min 隔5 min 测定1次，30 min之后隔10 min测定1次，待吸光度基本不变（前后2次差值小于0.01%）时视为样品与自由基反应完全，所有动力学实验均在室温条件下进行。

另外考虑到木质素溶液及对照品的本体吸收，还需测定2.7mlDPPH·溶液加0.3ml未溶解木质素的相应溶剂后的吸光值A0及0.3ml木质素溶液加2.7ml未溶解DPPH 的相应溶剂的吸光值A j。

由此可以按照公式计算抑制率，抑制率/% = [ 1 - (A i - A j ) /A0 ] ×100[3、7]。

1.2.5清除自由基能力的计算分别将0.3ml木质素溶液（50、100、150、200、250、300）与
2.7mlDPPH·溶液在比色皿中混合，在木质素溶液与DPPH反应达到稳定的时间后，在517nm 下测吸光值，绘制不同浓度供试品清除DPPH的曲线，计算得出DPPH·初始浓度减少至50%时所对应的供试品质量浓度即为半数有效浓度( EC50) [8]。

2.结果与分析
2.1 DPPH标准曲线在517nm下对7个浓度的DPPH溶液进行测定，得到DPPH标准曲线的线性回归方程为y=0.0055x+0.0198，R2=0.9973（极显著相关），说明在60~300μg/ml浓度范围内，DPPH与吸光度有较好的线性关系。

基金项目：东北林业大学院校共建大学生创新训练项目
作者简介：曹巍瀚（1990—），男，东北林业大学本科生
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作者简介：曹巍瀚（1990—），男，东北林业大学本科生
吸光度A 浓度/μg/ml
图1在517nm 下不同浓度的DPPH 标准曲线
2.4 木质素对DPPH 的动力学曲线以及清除率的分析
图2为不同浓度木质素磺酸钠水溶液与DPPH 反应动力学曲线，从图中可以看出，在50~500μg/mL 范围内，不同浓度下的木质素磺酸钠对DPPH 自由基的清除能力是不一样的，其中浓度为500μg/mL 的木质素磺酸钠溶液对DPPH 清除反应速率最快，浓度为150μg/mL ，200μg/mL 和400μg/mL 三个浓度下的木质素磺酸钠溶液对DPPH 的清除动力学曲线形状相近，浓度为50μg/mL ，300μg/mL 和500μg/mL 三个浓度下的木质素磺酸钠溶液对DPPH 的清除动力学曲线形状相近；浓度为100μg/mL 的木质素磺酸钠溶液在反应7200s 后，吸光度基本不变，所以反应时间到7200s 后停止。

清除率 (%)t (s)
图2木质素磺酸钠对DPPH· 反应动力学
图3为不同浓度木质素磺酸钠水溶液与DPPH 反应的lnc-t 关系曲线，下面只对符合一
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作者简介：曹巍瀚（1990—），男，东北林业大学本科生
级反应的时间段作出分析。

如图所示，浓度为50μg/mL 的木质素磺酸钠从反应开始到结束其反应符合一级反应，通过将lnc 对t 作图，求得该浓度下的反应速率常数k=-3×10-5。

浓度为100μg/mL 的木质素磺酸钠与DPPH 的反应从开始到结束可分为两个阶段，0～3600s
时符合一级反应，其k 值为5×10-5，3600s 以后反应趋于稳定。

当浓度为150μg/mL 时，
从其关系曲线看可以分为三个阶段，其反应速率常数分别为k 1=8×10-5，k 2=-3×10-5，k 3= 5×10-5。

当浓度为200μg/mL 时，有两个时间段符合一级反应关系，0～4800s 时k 1= 1×10-5，5400s~最后，k 2=3×10-5。

当浓度为300μg/mL 时，0~3600s ，k 1=6×10-5, 7200~结束k 2=2×
10-5。

当木质素磺酸钠的浓度为400μg/m 时，从12000~27000s 符合一级反应方程k=2×10-4。

当浓度为500μg/m 时，0~1800s 时，k 1=3×10-4，6600s~最后，k 2=4×10-5。

l n c
t (s)
图3木质素磺酸钠的lnc 与时间t 的关系图
图4为碱木质素对DPPH 清除动力学曲线，如图所示，当碱木质素的浓度由50μg/mL ， 100μg/mL ，150μg/mL ，200μg/mL ，250μg/mL 这五个浓度下的木质素磺酸钠溶液随木质素磺酸钠浓度的提高，与DPPH 反应的动力学曲线斜率逐渐增大，而300μg/mL 的木质素磺酸钠溶液对DPPH 的清除速度介于100μg/mL 和150μg/mL 之间。

将各浓度下的lnc 对t 作图，结果如图5所示，浓度为50μg/mL 的碱木质素从0~1000s ，浓度基本不变，相当于零级反应，斜率k 相当于零，而在1000~2500s 时，经计算反应速率常数k 为7.6×10-5。

浓度为100μg/mL ，150μg/mL ，200μg/mL ，250μg/mL ，300μg/mL 的碱木质素在整个反应阶段都满足一级反应，经计算k 分别为5.61×10-5，4.73×10-5，1.14×10-4，1.17×10-6，
5.86×10-5。

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作者简介：曹巍瀚（1990—），男，东北林业大学本科生
清除率 (%)t (s)
图4 碱木质素对DPPH 反应动力学
l n c t (s)
图5 碱木质素lnc 与时间t 的关系图
3结论
通过对木质素磺酸钠和碱木质素对DPPH 消除反应动力学进行研究，结果表明，浓度范围在50~500μg/mL 的木质素磺酸钠水溶液，随浓度不同，与DPPH 反应的速率不同，其中浓度为400μg/mL 的木质素磺酸钠清除DPPH 最为彻底，反应终止时，对DPPH 的清除率达97.4%。

浓度范围在50~300μg/m L 的碱木质素水溶液与DPPH 反应，获得的动力学曲线变化趋势近似，浓度为200μg/mL 和250μg/mL 的碱木质素有着较好的清除DPPH 自由基能力，反应终止时，对DPPH 的清除率分别为93.9%和94.6%。

参考文献：
［1］M P维纳德尔，V阿伽侗杜，M米特詹斯木质素作为抗氧化剂的应用研究日用化学品科学 2008,9：28 – 31
［2］张莹，雷中方造纸黑液提取木质素的抗氧化性研究复旦学报(自然科学版) 2010 ，2 ：60 – 64
［3］彭长连陈少薇林植芳林桂珠用清除有机自由基DPPH法评价植物抗氧化能力
生物化学与生物物理进展2000 ; 27 (6)：658 - 661
［4］曲欢欢，李白雪，燕菲，等．用清除有机自由基DPPH 法评价连翘不同部位抗氧化作用［J］．中国中医药信息杂志，2008，15( 增刊) : 32 － 34．
［5］张丽华，童华荣．抗氧化能力测定方法的研究进展［J］．中国食品添加剂，2004( 3) : 108 － 113．
［6］连喜军，王亮，王吰，等． DPPH 法研究不同品种甘薯抗性淀粉抗氧化性［J］．粮食与油脂，2009( 6) : 26 － 28．
［7］申海进，郭巧生，房海灵．野菊花60% 乙醇提取物的酚类成分组成及其清除自由基和防霉变能力分析［J］．植物资源与环境学报，2010，19( 1) : 20 － 25．
［8］徐金瑞，张名位，刘兴华，等．黑大豆种皮花色苷的提取及其抗氧化作用研究［J］．农业工程学报，2005，21( 8) : 161 － 164．
基金项目：东北林业大学院校共建大学生创新训练项目
作者简介：曹巍瀚（1990—），男，东北林业大学本科生。