生物分离实验

实验二蛋白质的分离鉴定
——纸层析法
一、目的
通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。

二、原理
纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。

层析溶剂由有机溶剂和水组成的。

物质被分离后在致层析图谱上的位置是用R f值（比移）来表示的：
R f=原点到层析中心的距离/原点到层析剂前沿的距离
在一定的条件下某种物质的R f值是常数。

R f值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。

本试验利用纸层析法分离氨基酸。

三、器材
1. 层析缸
2. 毛细管
3. 喷雾器
4.培养皿
5. 层析滤纸（新华一号）
四、试剂
1、扩展剂 650ml
是4份水和饱和的正丁醇和1份醋酸的混合物。

将20毫升的正丁醇和5毫升的冰醋酸放入分液漏斗中，与15毫升水混合，充分振荡，静止后分层，放出下层水层。

取漏斗内的扩展剂约5毫升置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒入培养皿中备用。

2、氨基酸溶液：各5ml
0.5%的谷氨酸，亮氨酸，色氨酸，甘氨酸溶液及它们的混合液（各组分浓度均为0.
5%）。

3、显色剂 50-100ml
0.1%水和茚三酮正丁醇溶液
五、操作方法
1、将盛有平衡溶剂的小烧杯置于密闭的层析缸中。

2、取层析滤纸（长22cm，宽14cm）一张。

在纸的一端距边缘2～3cm处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔2cm作一记号如图。

3、点样用毛细管将各氨基酸样品分别点在这五个位置上，干后再点一次。

每点在纸上的扩散直径最大不超过3mm。

4、扩展用线将滤纸缝成筒状，只得两边不能接触。

将盛有约20ml扩展剂的培养皿迅速的置于密封的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中（点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线1cm）到溶剂上升15-20cm时即取出滤纸，用铅笔描绘出溶剂前沿线，自然干燥或用吹风机热风吹干。

5、显色用喷雾器均匀的喷上0.1%的茚三酮正丁醇溶液；然后置于烘干箱烘干5分钟（1 00℃）就可显现出各个层析斑点
6、计算分析：
①判断混合氨基酸中的单组分。

②计算各种氨基酸的R f值（各种单组分、混合氨基酸液）。

实验三双水相萃取法的应用
六、目的要求
掌握双水相萃取法的基本原理及其在产物提取方面的应用
七、实验原理
利用不同物质在双水相系统中分配系数的差异，将不同物质分离。

八、材料和仪器
1.材料：鸡精、PEG（400～6000）、硫酸铵、pH试纸。

2.仪器：烧杯、分液漏斗。

九、实验方法
1.双水相系统的制备：分别称取12gPEG400和1000，加入两个烧杯中，加水至40mL使溶解，然后每个烧杯中分别加入硫酸铵6g使溶解，并加水至50mL，观察是否形成双水相，若无，每个烧杯中逐次增加硫酸铵1g，观察哪一个烧杯中双水相系统先形成，分析其原因。

2.将鸡精转入两个双水相系统中，搅拌均匀，测定pH值，静置观察分层情况及颜色变化，分析其原因。

3.两个双水相系统中，逐次改变pH值，观察两个双水相系统中上下层水相的颜色及混浊、沉淀等情况是否有变化，若有分析其原因。

十、思考题
1.双水相萃取的优缺点。

2.影响双水相萃取的因素有哪些？
实验四活性炭脱色
一、目的要求
掌握活性炭脱色的基本原理以及不同性质活性炭的脱色操作。

二、实验原理
活性炭表面有无数微小的空隙，因而具有很大表面积，能够将色素等杂质吸附在表面上。

三、材料和仪器
1.材料：鸡精、粉末活性炭、GH-15颗粒活性炭、NaOH、HCl、pH试纸。

2.仪器：烧杯、玻璃柱。

四、实验方法
1.粉末活性炭的脱色：取适量鸡精加水制成溶液，观察其颜色，然后加入一定量的粉末活性炭（其用量一般为鸡精量的3％左右），适当搅拌、静置过夜，观察颜色有无变化。

2.GH-15颗粒活性炭的脱色
（1）GH-15颗粒活性炭的预处理：将活性炭装柱，加水充分浸泡4h后，用60℃水洗至流出液pH8以下，然后用两倍碳体积的3～4％HCl再生，自来水洗至pH6.5左右。

（2）上柱脱色及水洗：上柱液顺向流过碳柱，控制流量为每小时碳体积的2～3倍。

进柱完毕，用40℃以下温水洗去残存在碳柱内的谷氨酸钠（回收），直洗至流出液0°Be以下。

（3）洗脱和再生：洗脱用水先进行反冲，使碳层松动，再用两倍碳体积的60℃4％NaOH，顺向上柱洗脱色素，待流出液pH9以下，关住阀门，让其浸泡4h，然后流出，再用60℃以上的热水洗涤至pH8.0以下。

再生用两倍碳体积的3～4％HCl再生，先浸泡2 h，然后流出，再用自来水洗至中性。

最后用自来水进行反冲，将碳末冲掉，至溢流水澄清即可停止反洗，平整碳柱，备用。

五、思考题
1.影响粉末活性炭脱色的因素有哪些，粉末活性炭可否洗脱、再生重复使用？
2.影响GH-15颗粒活性炭脱色的因素有哪些？
3.可否用离子交换树脂以及大孔吸附树脂进行脱色，你的设计思路是怎么样的？
实验五、蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳一、实验目的
1．了解电泳实验原理
2．掌握电泳实验操作规程
3．用电泳方法测定蛋白分子量
二、实验原理
聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构，具有分子筛效应，它具有两种形式，一种是非变性聚丙烯酰胺凝胶，蛋白质在电泳中保持完整的状态，蛋白在其中依三种因素分开：蛋白大小，形状和电荷。

而SDS-PAGE仅根据蛋白分子量亚基的不同而分离蛋白。

这个技术首先是1967年由shapiro建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，电荷因素可以忽视。

（解释：最广泛使用的不连续缓冲系统最早是由Ornstein(1964) 和Davis(1964) 设计的, 样品和浓缩胶中含 Tris(三羟甲基氨基甲烷)-HCl(pH 6.8), 上下槽缓冲液含Tris-甘氨酸(pH 8.3), 分离胶中含Tris-HCl(pH 8.8)。

系统中所有组分都含有0.1% 的 SDS(Laemmli, 1970)。

样品和浓缩胶中的氯离子形成移动界面的先导边界而甘氨酸分子则组成尾随边界，在移动界面的两边界之间是一电导较低而电位滴度较陡的区域, 它推动样品中的蛋白质前移并在分离胶前沿积聚。

此处pH 值较高，有利于甘氨酸的离子化，所形成的甘氨酸离子穿过堆集的蛋白质并紧随氯离子之后，沿分离胶泳动。

从移动界面中解脱后，SDS-蛋白质复合物成一电位和pH值均匀的区带泳动穿过分离胶，并被筛分而依各自的大小得到分离。

SDS与蛋白质结合后引起蛋白质构象的改变。

SDS-蛋白质复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形状的长椭园棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样（约为18Å，即1.8nm），而长轴则随蛋白质分子量成正比地变化。

这样的SDS-蛋白质复合物，在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是椭圆棒的长度也就是蛋白质分子量的函数。

由于SDS和巯基乙醇的作用，蛋白质完全变性和解聚，解离成亚基或单个肽链，因此测定的结果只是亚基或单条肽链的分子量。

SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离笵围取决于用于灌胶的聚丙烯酰胺的浓度和交联度。

在没有交联剂的情况下聚合的丙烯酰胺形成毫无价值的粘稠溶液，而经双丙烯酰胺交联后凝胶的刚性和抗张强度都有所增加，并形成SDS蛋白质复合物必须通过的小孔。

这些小孔的孔径随“双丙烯酰胺～丙烯酰胺”比率的增加而变小，比率接近 1：20 时孔径达到最小值。

SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰胺～丙烯酰胺”为1：29 配制，试验表明它能分离大小相差只有3% 的蛋白质。

凝胶的筛分特性取决于它的孔径，而孔径又是灌胶时所用丙烯酰胺和双丙烯酰胺绝对浓度的函数。

用5～15%的丙烯酰胺所灌制凝胶的线性分离范围如下表：SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围
*丙烯酰胺浓度（%）线性分离范围（kD）
15 12～43
10 16～68
7.5 36～94
5.0 57～212
*双丙烯酰胺～丙烯酰胺摩尔比为 1：29。

）
三、试剂与仪器
1．试剂
（1）丙烯酰胺和N, N’-亚甲双丙烯酰胺。

以温热（利于溶解双丙烯酰胺）的去离子水配制含有29%（w/v）丙烯酰胺和1%（w/v）N, N’-亚甲双丙烯酰胺的贮存液，丙烯酰胺和双丙烯酰胺在贮存过程中缓慢转变为丙烯酸和双丙烯酸，这一脱氨基反应是光催化或碱催化的，故应核实溶液的pH值不超过7.0。

这一溶液置棕色瓶中贮存于室温，每隔几个月须重新配制。

小心：丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤。

（2）十二烷基硫酸钠（SDS）。

SDS可用去离子水配成10%（w/v）贮存液保存于室温。

（3）用于制备分离胶和浓缩胶的Tris缓冲液。

（4）TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)。

TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。

（5）过硫酸铵。

过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。

须新鲜配制。

（6）1.5M Tris，pH8.8（分离胶缓冲液）
（7）1M Tris，pH6.8（浓缩胶缓冲液）
（8）Tris-甘氨酸电泳缓冲液。

25mM Tris
250mM 甘氨酸 (pH 8.3)
0.1% SDS
(9) 样品处理液
50mM Tris-HCl(pH 6.8)
100mM DTT(or 5% 巯基乙醇)
2% SDS
0.1% 溴酚蓝
10%甘油
（10）染色液：
0.1% 考马斯亮蓝 R250
40% 甲醇
10% 冰醋酸
(11）脱色液：
10% 甲醇
10% 冰醋酸
2．仪器
垂直平板电泳槽电泳仪DYY1-3
详见下：
图6-1 垂直平板电泳槽装置 1.垂直平板电泳槽
图6-2 仪器连接 2.电泳仪DYY1-3
四、实验步骤
1. 配制SDS聚丙烯酰胺凝胶所需的各种试剂
2．SDS聚丙烯酰胺凝胶的灌制（realplay）
⑴根据厂家说明书安装玻璃板。

⑵确定所需凝胶溶液体积，按下表给出的数值在一小烧杯中按所需丙烯酰胺浓度配制一定体积的分离胶溶液。

一旦加入TEMED，马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进入下步操作。

配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶溶液
⑶迅速在两玻璃板的间隙中灌注丙烯酰胺溶液,留出灌注浓缩胶所需空间(梳子的齿长再加0.5cm)。

再在胶液面上小心注入一层水（约2~3mm高），以阻止氧气进入凝胶溶液。

⑷分离胶聚合完全后（约30分钟），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。

⑸制备浓缩胶：按下表给出的数据，在另一小烧杯中制备一定体积及一定浓度的丙烯酰胺溶液，一旦加入TEMED，马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进入下步操作。

配制Tris-甘氨酸 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳5% 浓缩胶溶液
⑹聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶,立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。

小心避免混入气泡，再加入浓缩胶溶液以充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下。

⑺在等待浓缩胶聚合时，可对样品进行处理，在样品中按1:1体积比加入样品处理液，在100℃加热3分钟以使蛋白质变性。

⑻浓缩胶聚合完全后（30分钟），小心移出梳子。

把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入Tris-甘氨酸电极缓冲液。

必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。

⑼按予定顺序加样，加样量通常为10～25μl（1.5mm厚的胶）。

⑽将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为8V/cm。

当染料前沿进入分离
胶后，把电压提高到15V/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约1cm，然后关闭电源。

⑾从电泳装置上卸下玻璃板，用刮勺撬开玻璃板。

紧靠最左边一孔（第一槽）凝胶下部切去一角以标注凝胶的方位。

3．用考马斯亮蓝对SDS聚丙烯酰胺凝胶进行染色
经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品可用考马斯亮蓝R250染色。

染色1～2小时或过夜。

4. 换脱色液脱色，需3～10小时，其间更换多次脱色液至背景清楚。

此方法检测灵敏度为0.2～1.0 mg。

脱色后，可将凝胶浸于水中，长期封装在塑料袋内而不降低染色强度。

为永久性记录，可对凝胶进行拍照，或将凝胶干燥成胶片。

五、结果处理
测量并计算分子量
蛋白质的分子量与它的电泳迁移有一定关系式，经37种蛋白的测定得到以下的关系式：
Mw ＝ K (10－bm) (1)
lgMw = lg K －bm = K1－bm (2)
其中Mw是蛋白质分子量；K和K1为常数
b为斜率，m 是电泳迁移率，实际使用的是相对迁移率mR。

如果用几种标准蛋白质分子量的对数作纵坐标，用各自的相对迁移率作横坐标，即可画出一条斜率为负的标准曲线。

相对迁移率为：
mR = dpr / dBPB
其中，dpr、dBPB分别为样品和BPB（溴酚兰）以分离胶表面为起点迁移的距离。

欲求未知蛋白的分子量，只需求出它的相对迁移率：
mR未= dpr未/ dBPB
然后，从标准曲线上就可求出此未知蛋白的分子量。

取出脱色后的凝胶平放在两块透明投影胶片中间，赶尽气泡，在复印机上复印。

在复印的凝胶图上用直尺分别量出各条蛋白带迁移的距离dpr和dBPB（以蛋白带的上沿或中心为准），计算相对迁移率，根据方程式：
lgMw = K1－bmR
用各标准蛋白分子量的对数（纵坐标）和相对迁移率mR（横坐标）画出标准曲线，由标准曲线再求出其他各条待测和未知蛋白带的分子量，如有可能计算其误差。

四、思考题
1.简述SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理？
2.做好本实验的关键？
实验六、膜分离
一、实验目的
（1）熟悉膜分离的基本原理；（2）了解膜分离设备的结构及基本操作。

二、实验原理
膜是具有选择性分离功能的材料。

利用膜的选择性分离实现料液的不同组分的分离、纯化、浓缩的过程称作膜分离。

它与传统过滤的不同在于，膜可以在分子范围内进行分离，并且这过程是一种物理过程，不需发生相的变化和添加助剂。

膜的孔径一般为微米级，依据其孔径的不同（或称为截留分子量），可将膜分为微滤膜、超滤膜、纳滤膜和反渗透膜，根据材料的不同，可分为无机膜和有机膜，无机膜主要还只有微滤级别的膜，主要是陶瓷膜和金属膜。

有机膜是由高分子材料做成的，如醋酸纤维素、芳香族聚酰胺、聚醚砜、聚氟聚合物等等。

三、实验仪器
膜分离设备
四、实验步骤
1、试机。

根据电机要求接上 380V 三相电源，点触启动按钮检查泵电机叶片的转向判断泵的正反转，如果反转则调换任意两根进线。

2、开机准备。

检查所有阀门是否处于正常待机状态：泵进口阀，浓缩水循环阀，必须处于完全开启状态，同时关闭渗透侧出口阀和各个排放口。

3、向原水箱中加入足够量的自来水。

4、启动水泵，通过调节泵出口阀开度慢慢将操作压力升至指定值以保护膜延长膜的使用寿命，后调节膜出口阀来实现实验所需的操作压差及适当的循环流量。

5、通过调节水回收率，实现在不同操作压力条件下工作，记录各个操作压力下的出水电导率和流量。

6、实验完毕，按停机按钮，由PLC自动执行停机程序，最后关闭电源。

切记不能在实验结束后，直接关闭电源。

六、讨论
1、膜分离与过滤的区别？。