小麦抗白粉病相关基因GST克隆与表达

小麦抗白粉病相关基因GST克隆与表达
吴金华;张西平;胡言光;吉万全
【摘要】以从小麦抗白粉病相关基因差异表达分析中获得的EST-3 (Genbank序列号EX567360)为标签,采用电子克隆的方法对其进行延伸,并对电子克隆结果进行半定量RT-PCR验证,最后对白粉菌不同侵染时间进行了表达分析.经RT-PCR扩增,EST-3表达的带型变化趋势与其在抑制性消减杂交SSH-cDNA的差异显示情况一致,且RT-PCR获得的序列与电子克隆的序列一致性达98％.生物信息学分析表明,该序列是由875 bp核苷酸组成的,具有完整的开放阅读框架,编码蛋白为229个氨基酸,GenBank序列号JK841279,含有一个N端和C端谷胱甘肽硫转移酶结构域,该序列与小麦谷胱甘肽硫转移酶基因(GST)一致性较高,达97％.表达分析结果显示,白粉菌侵染24 h表达受到抑制,48 h开始表达,侵染72 h表达最强,96 h又开始下降,表明GST基因属于白粉菌诱导型相关基因,参与小麦对白粉病的应答反应.%The EST-3 related to the powdery mildew in the wheat was amplified by in silico cloning. And the cDNA sequence had been confirmed by RT-PCR. The result indicated that a new sequence with 875 bp length was cloned,which contained an integrated ORF,encoding 229 amino
acids,GenBank accession number is JK841279. Based on domain structure, it has GST domain structure in N-terminal and C-terminal. The trend of EST-3 expression by RT-PCR was very identity to the expression by SSH-cDNA,and their sequences have 98% consistency. As showed that the result of in silico cloning was right. The amino acid sequence showed highly comparability with the glutathione-S-transferase(GST) from GenBank,and their sequences have 97% consistency. Expression analysis
revealed that the expression of GST in wheat was inhibited after infection
by powdery mildew for 24 h,then it began to express after infection for 48 h and increased gradually. It reached the highest level after infection for 72 h,and decreased after infection for 96 h. The result suggested that GST belong to the gene induced by powdery mildew,and it might be involved
in powdery mildew response of wheat.
【期刊名称】《西北植物学报》
【年(卷),期】2013(033)001
【总页数】5页(P34-38)
【关键词】小麦;白粉病;小麦谷胱甘肽硫转移酶基因(GST);电子克隆
【作者】吴金华;张西平;胡言光;吉万全
【作者单位】西北农林科技大学农学院,陕西杨陵712100
【正文语种】中文
【中图分类】Q786
全基因组测序并不是发现基因最有效的方法，因为基因组中只有2%的序列编码蛋白质［1］。

作为cDNA部分序列的表达序列标签（expressed sequence tags，ESTs）已成为寻找未知功能新基因及克隆不同时空差异表达基因的重要途径［2］。

通过mRNA差异显示或SSH－cDNA等方法获得ESTs后，研究者们都迫切希望
迅速克隆到其全长cDNA序列，以便对该基因的功能进行研究［1］。

电子克隆（in silico cloning）策略是采用生物信息学方法（包括序列同源检索、聚类和拼
接等）延伸EST序列，以期快速克隆基因部分乃至全长的新技术［3］。

刘庆坡等［4］采用基于EST的电子克隆方法得到了一段长1 611bp的cDNA序列。

高兴
春等［5］应用电子克隆技术在大规模cDNA克隆测序的背景下，成功预测了一个EST的全长序列，并经RT－PCR扩增获得预期片段。

反转录聚合酶链式反应（RT －PCR）是一种直观、简单易行的基因表达验证方法，对实验条件要求不高，理论上有一个单拷贝cDNA模板即可完成扩增，具有较高灵敏度［6］。

董宏平等［7］用半定量RT－PCR方法测定了18个信号传导调控基因表达情况，并对其可信度
做了研究，表明该方法能够准确检测不同基因表达的相对水平。

孙晓红等［8］应用半定量PCR反应分析了4个冷诱导相关基因的表达差异。

张丽娜等［9］利用
半定量技术研究了与白粉病有关的小麦TaMlo－A1c基因的表达。

王华忠等［10
－11］分析了 TaTBL、TaPK1和 TaTST 等3个抗病相关基因的功能，结果表明3个基因在表皮细胞中的瞬间表达，均能在一定程度上抑制白粉菌附着孢的成功侵入和吸器的形成，进而阻止菌落的形成，在一定程度上增强了表达细胞对白粉菌的抗性；并进一步获得转TaTBL基因植株5株，转TaTST基因植株6株，转基因植株离体叶片的人工接种实验表明，外源基因的导入不同程度上增强了植株的白粉病抗性，表现为延缓了白粉菌的发育。

本试验在构建小麦白粉病抑制性消减杂交文库的基础上，采用电子克隆的方法，对获得的小麦谷胱甘肽硫转移酶基因（GST）相关的表达序列标签EST－3进行序列延伸，利用生物信息学的方法将该序列与GenBank数据库中的同源蛋白进行比对分析，得到具有完整阅读框的小麦GST基因的cDNA序列，并采用RT－PCR对
其表达特性进行验证分析，为小麦抗白粉病育种及其进一步的功能研究奠定基础。

1 材料和方法
1.1 材料
以西北农林科技大学农学院培育的小麦种质N9436（多小穗、高抗白粉病）为试
材，将幼苗在温室内培养3周后，采用涂抹法接种陕西关中地区白粉菌优势小种
‘关中4号’，以不接种为对照。

接种后植株罩以透明塑料桶，保湿保温以利于
病原菌侵染。

接种后24、48、72和96h分别剪取对照和接种材料的叶片约0.2g，置于液氮中研磨，提取总RNA。

1.2 目的片段的获得
以抑制性消减杂交文库中获得的EST－3（Genbank序列号EX567360）为依据，在GenBank的dbEST数据库进行同源搜索，将Unigene的所有EST序列下载，将所下载高度同源的ESTs归类，作为种子序列库，进行序列拼装，构建序列重叠群（contig），再以此重叠群为种子序列，再次进行BLAST比对和序列拼接，延
伸重叠群序列，如此重复以上步骤，直至重叠群不再进行延伸。

总RNA提取及cDNA合成参照文献［12］。

目的片段的回收采用凝胶回收试剂
盒（安徽优晶）。

将回收的目的片段连接到pGEM－T Easy载体（Promega，USA）、转化大肠杆菌、挑取阳性克隆、提取质粒，送上海桑尼生物公司进行测序。

1.3 表达模式分析
以文库中部分EST为模板，利用Primer Premier 5进行引物设计（表1），由上海生工生物工程公司合成。

以18SrRNA为内参基因，在内参基因PCR产物进入平台期前结束PCR，根据PCR的指数增长曲线，选择产量高而又位于平台期前的循环次数。

对反转录后的cDNA用18SrRNA作为内参基因调整模板浓度。

表1 RT－PCR分析所用的引物序列及反应温度Table 1 Primer sequences and Tm values of RT－PCR引物Primer假定基因Putative gene引物序列Primer sequence（5′－3′）退火温度Anneal ing temperature/℃EST－3 Glutathione
－S－transferase L：ACTACTCCCTCCATGCCTAT R：
CATCCCGTTCACCTTCTACT 50 18SrRNA L：CTTCTTAGAGGGACTATGGC R：TACGGAAACCTTGTTACGAC 53
反应体系：10×PCR Buffer 2μL，dNTP（2 mmol/L）2μL，正向和反向引物（10mmol/L）各0.5 μL，Taq DNA polymerase（5U/μL）0.2μL，ddH2O补
齐至20μL。

反应程序为：95℃预变性2min；95℃40s，50～56℃45s，72℃40s，共35个循环；72℃延伸10min，反应后于4℃保温，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结果与分析
2.1 目的片段的获得及生物信息学分析
利用Bio Edit软件对dbEST数据库搜索得到的相关ESTs序列进行EST序列片段
拼接，根据拼接序列设计引物，以小麦N9436的cDNA为模板，用所设计的引物进行PCR扩增，扩增产物经凝胶电泳后得到约1 100bp的条带（图1）。

将此凝胶片段进行回收，采用T－A克隆法连接到pGEM－T载体上进行测序。

去除载体及接头序列后得到一个875 bp的序列（GenBank序列号JK841279），然后在NCBI的非冗余蛋白数据库进行Blast（http：
///blast/Blast.cgi）比对。

结果表明，该序列与小麦谷胱
甘肽硫转移酶同源性较高，期望值为5e－117、分值为424，一致性为97%。

根
据Blast比对结果，应用ORF finder分析表明，该序列包括完整的编码229个氨基酸的开放阅读框，且具有起始密码子atg和终止密码子tag（图2）。

将得到的氨基酸序列通过Blastp分析蛋白质结构域，结果表明含有一个N端和C端谷胱甘肽硫转移酶结构域（图3）。

通过在NCBI下载小麦、大麦、水稻、玉米等谷胱甘肽硫转移酶序列多重比较并构建系统进化树（图4）。

从图4中可知，在分子进化水平上，本研究中所获得的小麦GST基因序列与NCBI已公布的其他种类的小麦GST一致性为94%，与水稻
的GST一致性最低（56%）。

图1 RT－PCR扩增结果Fig.1 Amplification result of RT－
PCRM.DL2000marker
2.2 白粉菌不同侵染时间的表达分析
内参基因18SrRNA在白粉菌接种后不同时间表达均一，表明该RT－PCR体系符合表达分析的要求。

白粉菌接种后不同时间GST的表达情况及表达量分别如图5所示，未接种时本身具有一定的表达量，接种白粉菌24h表达受到抑制，甚至无表达，接种48h又有表达，一直持续到72h达到最强，接种后96h又开始下降。

这一结果进一步表明，白粉菌对GST的表达具有诱导作用。

GST的生物合成受白粉菌侵入的诱导，是白粉菌诱导型相关基因，参与抗白粉病反应。

图5 GST在白粉菌不同处理时间的表达分析Fig.5 GSTexpression with powdery mildew after inoculation at different time
3 讨论
在病菌与寄主互作中，植物主要是通过防卫基因的表达、过敏反应和系统获得性抗性等来抵抗病菌的入侵。

谷胱甘肽硫转移酶是生物体内一种重要的解毒酶，分为细胞内可溶性酶和膜相关蛋白两部分［13］。

其主要功能是催化亲核试剂谷胱甘肽与有害的亲电试剂结合，产生易溶于水的复合物而利于排出体外，以保护细胞内核酸和蛋白质的其他亲核中心［14］。

谷胱甘肽硫转移酶在细胞质中还能清除植物抗病过程中积累的还原性氧类（ROS），减少ROS的毒性和破坏性作用，参与毒素的分解代谢。

因此，谷胱甘肽硫转移酶可以对多种有毒的内源性和外源性亲电物质解毒［15－16］。

谷胱甘肽硫转移酶的生物合成受生物胁迫因子（如病原菌的
侵入等）与非生物胁迫因子（如热激等）的诱导，参与细胞对各种毒素及胁迫的抗性反应［17］。

Enayati等［18］证明GST与昆虫抗药性有关，可作为杀虫剂的三大解毒代谢酶系之一。

马金彪等［19］构建的小麦条锈菌cDNA文库中有GST 基因的表达。

有研究表明，小麦接种白粉病菌后，植株在短期内启动防御体系，小麦获得性抗性系统（SAR）的启动一般发生在白粉病菌接种24h后［20］。

本研究克隆到的GST片段，在接种白粉菌72h后表达量达到最高。

尽管本身在白粉菌未侵染时GST有一定的表达，但是在白粉病侵染初期（24h）GST低丰度表达甚至不表达，在白粉菌侵染72h时，GST从低丰度表达的状态中被激活，表达量迅速增加，说
明GST的表达能够受到不同侵染时间的诱导或抑制，也暗示其在参与白粉病抗病
反应时不同侵染时间下，可能处于不同水平的活性状态。

这些均为深入认识该基因功能及其参与白粉病抗病反应中的机理奠定了基础。

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