肺癌患者外周血及组织中γδT细胞的分布特征及意义

㊃论著㊃
肺癌患者外周血及组织中γδT细胞的分布特征及意义*
尚文雯1,徐睿1,陈献1,姚莎莎1,金淑贤2,张晓洁1ә
(1.南京医科大学第一附属医院检验学部/国家重点临床检验专科建设单位,江苏南京210029;
2.南京医科大学第一附属医院呼吸与危重症医学科,江苏南京210029)
摘要:目的探讨肺癌患者外周血和组织中γδT细胞及其亚群的分布特征及临床意义㊂方法流式细胞术检测10例肺癌患者外周血㊁20例健康对照者外周血㊁15例肺癌患者癌组织及其癌旁正常组织中γδT细胞㊁Vδ1T细胞和Vδ2T细胞的表达水平㊂结果肺癌患者外周血中Vδ2T细胞的表达水平显著低于健康对照者,差异有统计学意义(P<0.001);肺癌患者癌组织中浸润的γδT细胞(P<0.001)和Vδ1T细胞(P< 0.001)表达水平显著高于癌旁正常组织;肺癌患者癌组织中浸润的Vδ1T细胞表达水平与淋巴结转移相关(P<0.05)㊂结论肺癌患者外周血及癌组织中γδT细胞及其亚群具有截然不同的分布特征,癌组织浸润的Vδ1T细胞表达水平与淋巴结转移有关,提示γδT细胞及其亚群可能参与肺癌病程的进展㊂
关键词:肺癌;γδT细胞; Vδ1T细胞; Vδ2T细胞
D O I:10.3969/j.i s s n.1673-4130.2020.11.003中图法分类号:R734.2
文章编号:1673-4130(2020)11-1291-05文献标识码:A
D i s t r i b u t i o n c h a r a c t e r i s t i c s a n d s i g n i f i c a n c e o fγδT c e l l s i n p e r i p h e r a l b l o o d
a n d t i s s u e s o f p a t i e n t s w i t h l u n g c a n c e r*
S HA N G W e n w e n1,X U R u i1,C H E N X i a n1,Y A O S h a s h a1,J I N S h u x i a n2,Z HA N G X i a o j i e1ә(1.D e p a r t m e n t o f C l i n i c a l L a b o r a t o r y,t h e F i r s t A f f i l i a t e d H o s p i t a l o f N a n j i n g M e d i c a l U n i v e r s i t y,
N a n j i n g,J i a n g s u210029,C h i n a/N a t i o n a l K e y C l i n i c a l L a b o r a t o r y S p e c i a l t y C o n s t r u c t i o n U n i t,
N a n j i n g,J i a n g s u210029,C h i n a;2.D e p a r t m e n t o f R e s p i r a t o r y a n d C r i t i c a l C a r e M e d i c i n e,
t h e F i r s t A f f i l i a t e d H o s p i t a l o f N a n j i n g M e d i c a l U n i v e r s i t y,N a n j i n g,J i a n g s u210029,C h i n a)
A b s t r a c t:O b j e c t i v e T o i n v e s t i g a t e t h e d i s t r i b u t i o n a n d c l i n i c a l s i g n i f i c a n c e o fγδT c e l l s a n d t h e i r s u b s e t s i n p e r i p h e r a l b l o o d a n d t i s s u e s o f p a t i e n t s w i t h l u n g c a n c e r.M e t h o d s F l o w c y t o m e t r y w a s u s e d t o d e t e c t t h e e x p r e s s i o n o fγδT c e l l s,Vδ1T c e l l s a n d Vδ2T c e l l s i n p e r i p h e r a l b l o o d o f10l u n g c a n c e r p a t i e n t s,20h e a l t h y c o n t r o l s,t h e c a n c e r t i s s u e a n d t h e a d j a c e n t n o r m a l t i s s u e s o f15l u n g c a n c e r p a t i e n t s.R e s u l t s T h e e x p r e s s i o n l e v e l o f Vδ2T c e l l s i n t h e p e r i p h e r a l b l o o d o f l u n g c a n c e r p a t i e n t s w a s s i g n i f i c a n t l y l o w e r t h a n t h a t o f t h e
h e a l t h y c o n t r o l g r o u p(P<0.001),t h e e x p r e s s i o n l e v e l s o fγδT c e l l s(P<0.001)a n d Vδ1T c e l l s(P<0.001)
i n f i l t r a t e d i n t h e c a n c e r t i s s u e s o f l u n g c a n c e r p a t i e n t s w e r e s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n t h o s e i n t h e a d j a c e n t n o r-m a l t i s s u e s,a n d t h e e x p r e s s i o n l e v e l o f Vδ1i n f i l t r a t e d i n t h e c a n c e r t i s s u e s o f l u n g c a n c e r p a t i e n t s w a s s i g n i f i-c a n t l y h i g h e r t h a n t h a t i n t h e n o r m a l t i s s u e s;c o r r e l a t e d w i t h l y m p h n o d e m e t a s t a s i s(P<0.05).C o n c l u s i o n T h e d i s t r i b u t i o n o fγδT c e l l s a n d t h e i r s u b s e t s i n p e r i p h e r a l b l o o d a n d c a n c e r t i s s u e s o f p a t i e n t s w i t h l u n g c a n c e r i s q u i t e d i f f e r e n t.T h e e x p r e s s i o n l e v e l o f Vδ1T c e l l s i n f i l t r a t e d b y c a n c e r t i s s u e s i s r e l a t e d t o l y m p h n o d e m e t a s t a s i s,s u g g e s t i n g t h a tγδT c e l l s a n d t h e i r s u b s e t s m a y b e i n v o l v e d i n t h e p r o g r e s s i o n o f l u n g c a n c e r.
K e y w o r d s:l u n g c a n c e r;γδT c e l l s; Vδ1T c e l l s; Vδ2T c e l l s
肺癌的发病率和病死率位居全球恶性肿瘤之首,发病率逐年上升㊂其中,非小细胞肺癌(N S C L C)占所有肺癌的85.00%左右,约75.00%的患者发现时已为晚期,5年生存率很低[1]㊂传统肿瘤疗法包括手术㊁
㊃1921㊃
国际检验医学杂志2020年6月第41卷第11期I n t J L a b M e d,J u n e2020,V o l.41,N o.11
*基金项目:国家自然科学基金项目(81772779);江苏省六大高峰人才项目(2015-W S N-034);江苏省六个一工程拔尖人才项目(L G Y2017068);江苏省重点人才基金项目(Z D R C A2016003);江苏省 科教强卫 实验诊断学重点实验室项目(Z D X K B2016005)㊂作者简介:尚文雯,女,技师,主要从事肿瘤免疫与分子诊断研究㊂ә通信作者,E-m a i l:n j z h a n g x j@163.c o m㊂
本文引用格式:尚文雯,徐睿,陈献,等.肺癌患者外周血及组织中γδT细胞的分布特征及意义[J].国际检验医学杂志,2020,41(11):1291-1295.
化疗和放疗对N S C L C的治疗效果欠佳,不能有效改善患者的生存期和生活质量㊂近年来免疫治疗包括肿瘤浸润性T淋巴细胞疗法(T I L)㊁嵌合抗原受体T 细胞疗法(C A R-T)㊁T细胞受体疗法(T C R-T)及免疫卡控点修饰法(C T L A-4㊁P D-1/P D L1)等免疫治疗方法已取得较大进展,逐渐应用于N S C L C的治疗,但由于N S C L C复杂的肿瘤免疫微环境,其治疗效果与预期仍有很大差距[2-3]㊂因此进一步深入研究肺癌的免疫抑制微环境,有助于打破肿瘤形成的免疫耐受,为肺癌的免疫治疗提供更为广阔的前景㊂
1资料与方法
1.1一般资料本研究经南京医科大学第一附属医院(下称本院)伦理委员会批准,所有患者或家属均签署知情同意书㊂病例纳入标准:(1)年龄20~70岁初诊患者,未曾接受过其他外科手术㊁放化疗及免疫抑制治疗;(2)临床诊断明确,且均经细胞学或组织学病理确诊;(3)无其他恶性肿瘤病史,无其他严重并发症;(4)健康对照者为同期体检健康者㊂本研究根据纳入标准收集了2017年7月至2018年10月就诊于本院的15例肺癌患者的癌组织及其相应癌旁正常组织(距癌>5c m),并收集相对应的10例肺癌患者外周血,患者年龄35~70岁,平均61岁;男8例,女7例;其中肺腺癌13例,肺鳞癌2例;根据国际抗癌联盟(U I C C)第8版肺癌T NM分期标准[4],Ⅰ期2例,Ⅱ期12例,Ⅲ期1例;有淋巴结转移7例,无淋巴结转移8例㊂同时收集同期20例年龄匹配的体检健康者外周血作为健康对照组,健康对照组年龄32~70岁,平均58岁;男11例,女9例㊂
1.2单个核细胞制备外周血用F i c o l l淋巴细胞分离液(T B D,中国)密度梯度离心获得单个核细胞(P B-M C)㊂新鲜的肺癌组织和癌旁正常组织用无菌外科剪剪碎,加入含有D N a s eⅠ(50U/m L,S i g m a)㊁透明质酸酶(100μg/m L,S i g m a)㊁胶原酶Ⅳ(1m g/m L, S i g m a)和L-谷氨酰胺(2μm o l/L,S i g m a)的R P M I 1640培养基中室温摇床消化2h㊂100mm筛网(B D F a l c o n,美国)过滤后获得单细胞悬液,用P e r c o l l细胞分离液(G E H e a l t h C a r e L i f e S c i e n c e s,美国)梯度离心得到组织浸润的单个核细胞㊂
1.3流式细胞术取1ˑ106个单个核细胞,加入
A l e x a F l u o r750-a n t i-C D45,A l e x a F l u o r700-a n t i-C D3,
B V421-a n t i-T
C Rγδ,F I T C-a n t i-Vδ1和P E-a n t i-Vδ2流式抗体(B i o l e g e n d,美国),室温下避光孵育20 m i n,进行细胞膜表面标记,洗涤后加入300μL P B S 重悬细胞,F A C S A r i aⅡ(B
D B i o s c i e n c e s,美国)流式细胞仪检测㊂以F S C和S S C定义淋巴细胞,从C D45+阳性门里分析C D3+γδ+T细胞的比例,并从γδ+T阳性门里分析Vδ1T㊁Vδ2T细胞所占比例㊂1.4统计学处理用S P S S20.0统计学软件进行数据处理,各组数据以xʃs表示,同1例肺癌患者癌组织及其癌旁正常组织中各变量的比较采用配对t检验,其余各组变量的比较采用独立样本t检验,以P< 0.05为差异有统计学意义㊂
2结果
2.1肺癌患者外周血γδT细胞㊁Vδ1T细胞和Vδ2 T细胞的表达水平图1A㊁B分别显示1例健康对照者和1例肺癌患者外周血中γδT细胞㊁Vδ1T㊁Vδ2T 细胞的流式检测图㊂以健康对照者为例,其外周血中γδT细胞比例为2.91%,Vδ1T细胞比例为8.97%, Vδ2T细胞比例为82.80%㊂图1C㊁D㊁E显示γδT细胞㊁Vδ1T细胞㊁Vδ2T细胞表达比例的统计学分析结果㊂健康对照组外周血中γδT细胞比例为(6.87ʃ1.27)%,Vδ1T细胞比例为(19.13ʃ
3.85)%,Vδ2T 细胞比例为(66.45ʃ
4.65)%;肺癌患者外周血中γδT细胞(
5.87ʃ1.38)%和Vδ1T细胞(11.50ʃ3.70)%的表达水平与健康对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);而Vδ2T细胞(23.69ʃ8.84)%表达水平则显著低于健康对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)㊂
2.2肺癌患者癌组织浸润的γδT细胞㊁Vδ1T细胞和Vδ2T细胞的表达水平图2A㊁B分别显示同1例肺癌患者癌组织和癌旁正常组织中γδT细胞㊁Vδ1 T㊁Vδ2T细胞的流式检测图㊂以癌旁正常组织为例,其γδT细胞比例为25.10%,Vδ1T细胞比例为47.90%,Vδ2T细胞比例为1.65%㊂图2C㊁D㊁E显示γδT细胞㊁Vδ1T细胞㊁Vδ2T细胞表达比例的统计学分析结果㊂肺癌患者癌旁正常组织中浸润的γδT细胞比例为(2
3.25ʃ2.06)%,Vδ1T细胞比例为(48.80ʃ
4.23)%,Vδ2T细胞比例为(4.10ʃ1.34)%;癌组织中浸润的γδT细胞(32.68ʃ2.83)%和Vδ1T细胞(63.92ʃ4.17)%水平显著高于癌旁正常组织,差异具有统计学意义(P<0.05);而癌组织中浸润的Vδ2 T细胞表达水平(1.60ʃ0.53)%则与癌旁正常组织比较差异无统计学意义(P>0.05)㊂
2.3肺癌患者外周血和癌组织中γδT细胞㊁Vδ1T 细胞和Vδ2T细胞的分布特征本文进一步比较肺癌患者外周血和癌组织中浸润的γδT细胞㊁Vδ1T细胞和Vδ2T细胞的表达水平,如图3A㊁B㊁C所示:肺癌患者癌组织中浸润的γδT细胞[(32.68ʃ2.83)% v s.(5.87ʃ1.38)%,t=7.319,P<0.001)]和Vδ1 T细胞[(6
3.92ʃ
4.17)%v s.(11.50ʃ3.70)%,t= 8.815,P<0.001)]的水平明显高于外周血,而Vδ2T 细胞的水平则明显低于外周血,差异具有统计学意义[(1.60ʃ0.53)%v s.(23.69ʃ8.84)%,t=3.082, P<0.01)]㊂
㊃2921㊃国际检验医学杂志2020年6月第41卷第11期I n t J L a b M e d,J u n e2020,V o l.41,N o.11
2.4 肺癌患者癌组织浸润的γδT 细胞㊁V δ1T 细胞
和V δ2T 细胞的水平与淋巴结转移的关系 本文进
一步将15例肺癌患者分为有淋巴结转移组和无淋巴
结转移组,并比较癌组织中浸润的γδT 细胞㊁V δ1T
细胞和V δ2T 细胞的表达水平,如图4A ㊁B ㊁C 所示:有淋巴结转移的肺癌患者浸润的V δ1T 细胞水平显
著高于无淋巴结转移的患者,差异具有统计学意义
[(57.87ʃ4.94)%v s .(40.86ʃ5.44)%,t =2.289,
P <0.05)];而浸润的γδT 细胞[(24.79ʃ1.95)%
v s .(21.91ʃ3.54)%,t =0.683,P >0.05)和V δ2T
细胞的水平差异无统计学意义[(2.50ʃ1.44)%v s .
(5.51ʃ2.14)%,t =1.131,P >0.05
]
㊂ 注:健康对照组20例,肺癌组10例;
***
表示P <0.001;n s 表示差异无统计学意义㊂
图1 流式细胞术检测肺癌组和健康对照组外周血中γδT 细胞㊁V δ1T 细胞和V δ2T
细胞的表达水平
注:癌旁正常组织15例,癌组织15例,
***
表示P <0.001㊂
图2 流式细胞术检测肺癌患者癌组织和癌旁正常组织中浸润的γδT 细胞㊁V δ1T 细胞和V δ2T 细胞的表达水平
㊃
3921㊃国际检验医学杂志2020年6月第41卷第11期 I n t J L a b M e d ,J u n e 2020,V o l .41,N o .11
注:癌组织15例,外周血10例;
**
表示P <0.01,***
表示P <0.001㊂
图3 肺癌患者外周血和癌组织中γδT 细胞㊁V δ1T 细胞和V δ2T
细胞的表达水平
注:有淋巴结转移7例,无淋巴结转移8例;*
表示P <0.05,n s 表示差异无统计学意义㊂
图4 肺癌患者癌组织浸润的γδT 细胞㊁V δ1T 细胞和V δ2T 细胞的水平与淋巴结转移的关系
3 讨 论γδT 细胞是一类广泛分布于外周血和黏膜上皮
组织的非组织相容复合体限制性固有T 淋巴细胞㊂既往研究表明,γδT 细胞可以通过多种机制介导抗肿瘤免疫效应,如释放穿孔素和颗粒酶介导靶细胞的凋亡;释放γ-
干扰素等细胞因子参与抗肿瘤免疫调节;抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用;通过乙型跨膜糖蛋白(F a s L )
和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(T R A I L )途径发挥抗肿瘤作用;N K 细胞2D 受体
(N K G 2D )直接识别并杀伤靶细胞[5-6]
,因此γδT 细胞
具有广泛的抗肿瘤谱㊂然而,越来越多的证据表明,
γδT 细胞既可发挥细胞毒效应杀伤肿瘤细胞,
又能介导肿瘤细胞的免疫逃逸[
7
]㊂据报道,不同的γδT 细胞亚群具有不同的免疫效应功能,其中V δ1T 细胞在上皮性肿瘤中具有免疫抑
制作用㊂R N G 等[8]研究发现,
直肠癌组织中浸润的V δ1T 细胞比例显著增高,
并与肿瘤分期呈正相关关系,而V δ2T 细胞比例显著降低,
与肿瘤分期呈负相关关系,V δ1T 细胞具有免疫抑制作用,
可以抑制初始C D 4+
T 细胞的增殖,而V δ2T 细胞具有杀伤活
性,可以杀伤直肠癌细胞;MA 等[9]
研究表明,
乳腺癌组织中γδT 细胞的增高是其临床预后的独立危险因素,与肿瘤大小㊁临床分期㊁淋巴结转移㊁术后生存时间等不良临床结局相关,且V δ1T 细胞可以抑制初始
T 细胞和效应T 细胞的功能,阻滞抗原提呈细胞D C
的成熟来参与肿瘤免疫抑制[10-11]㊂L U 等
[12
]研究显示,V δ2T 细胞与A T M /A T R 通路联合可以增强对
卵巢癌细胞的杀伤作用㊂与之相符,本研究发现,肺
癌患者癌组织中以V δ1T 细胞的细胞亚群为主,
且γδT 细胞和V δ1T 细胞的比例较癌旁组织明显升高;而外周血中V δ2T 细胞显著降低,说明γδT 细胞的
两种不同亚群可能在外周血和肿瘤组织中发挥着不同的效应功能㊂
肿瘤浸润的γδT 细胞可以通过募集免疫抑制细
胞等方式帮助肿瘤免疫抑制微环境的建立,促进肿瘤的发生发展㊂乳腺癌细胞分泌的趋化因子I P -10可招募外周γδT 细胞到肿瘤局部,阻断I P -10介导的γδT
的迁移可以增强肿瘤特异性T 细胞的抗肿瘤效应[13]
㊂对结直肠癌的研究发现,γδT 17细胞可通过分泌多种细胞因子如白细胞介素-17A 促进骨髓来源的
抑制性细胞(M D S C s
)的招募㊁增殖和存活,帮助维持肿瘤的免疫抑制微环境,促进肿瘤进展[
14]
㊂胰腺癌组织浸润的γδT 细胞通过抑制αβ
T 细胞的活化促进胰腺癌的进展[15
]㊂本研究结果提示,肺癌患者癌组织中
以V δ1T 细胞亚群浸润为主,增高的V δ1T 细胞与
肺癌患者的淋巴结转移相关,表明癌组织中浸润的
㊃
4921㊃国际检验医学杂志2020年6月第41卷第11期 I n t J L a b M e d ,J u n e 2020,V o l .41,N o .11
Vδ1T细胞可能在促进肺癌的病程进展中发挥重要的作用㊂当然,有关γδT细胞及其亚群在肺癌组织中表达及与临床特征的关系还需要更大样本的研究,γδT细胞及其亚群在肺癌肿瘤微环境中发挥的免疫功能及机制也值得进一步深入探讨㊂
4结论
深入研究γδT细胞及其亚群可能有助于判断肺癌患者的免疫状况及预后,有望为肺癌免疫检测与免疫治疗提供潜在的靶点㊂本文的研究显示,肺癌患者癌组织表达高水平的Vδ1T细胞,且与淋巴结转移相关,可能有望成为肺癌免疫治疗的潜在靶点㊂
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国际检验医学杂志2020年6月第41卷第11期I n t J L a b M e d,J u n e2020,V o l.41,N o.11。