海洋生物技术第五章 海洋动物基因工程讲述

（3）受体细胞和重组基因的导入（转化或转染）
将目的基因克隆到大肠杆 菌细胞中的操作步骤： 1．获得目的基因和质粒载体；
2．形成重组质粒；
3．制备感受态细胞，用重组质粒 转化大肠杆菌细胞；
4．培养大肠杆菌，让重组质粒及 外源目的基因形成大量拷贝； 5．筛选含重组质粒的大肠杆菌细 胞，进行检查或鉴定。
（5）载体的分子量要小
（6）细胞内稳定性高 目前最常用的载体包括细菌质粒、l 噬菌体、 cosmid质粒等。
载体的种类和特征
受体细胞 质粒* 结构 环状 线状 环状 插入片断 < 8* 9 - 24kb 〈 10 kb 举例 pUC18/19 , T-载体 pGEM- 3z等 EMBL系列， Λ gt系列 M13mp系列 pJB8,c2RB, pcoslEMBL, pWE15/16, pCV Pel oBAC系列 PCYPAC1

2003 第一只体细胞克隆动物（绵羊）“多莉”死亡； 中国大陆、台湾、香港科学家宣布联手启动“中华人类基 因组单体型图”计划；中、美、日、德、法、英6国科学 家联合宣布完成人类基因序列图；中、美科学家分别测定 出非典型肺炎病毒的基因图谱。
2004 FDA 批准首个抗血管生成因子的抗癌药物 Avastin ；美 国首个RNAi产品进入临床；FDA发现生物技术大麦是安 全的 2005 联合国通过《关于人类的克隆宣言》；多国科学家宣布 完成水稻基因组序列全图图谱的绘制； ADM公司计划在 美国建立首家生物柴油工厂；在当时能被清楚识别出的 将近2.4万种人类基因中，有20％都已经在美国获得了专 利；世界卫生组织指出，针对转基因食品所作的上市前 评估都没有发现对人类健康会有任何不利的影响；德国 科学家绘制出首张人类蛋白质互作图谱，耶鲁大学科学 家首次详细描绘出细胞信号转导网络
基因的分子生物学
（2）重组DNA技术的基本过程
目的基因的制备 载体的选择和制备 DNA分子的体外连接 将外源DNA导入宿主细胞 目的基因的筛选和鉴定

重组DNA的操作
宿主菌或受体细胞
大肠杆菌 酵母 昆虫细胞 哺乳动物细胞 感受态细胞（competent cell）
用 1985 第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国转基因鱼 1993 基因工程西红柿在美国上市


1997 1999.9
英国罗斯林研究所多莉羊 中国获准加入人类基因组计划.负责测定人类基 科学家公布人类基因组工作草图 公布人类基因组基本信息
因组全部序列的1%

2000.6.26 2001.2.11
工具酶 载体 重组DNA技术的基本过程 真核细胞转染 克隆基因的表达

3、工具酶
常用的工具酶：
限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶Ⅰ 切割DNA 生成3′- 5′磷酸二酯键 探针标记、补平3′末端
反转录酶
多聚核苷酸激酶 末端转移酶
cDNA合成
5′磷酸化、探针标记 3′末端多聚尾
E.coli E.coli E.coli
λ 噬菌体 丝状噬菌体及噬菌粒
粘粒载体
BAC (Bacterial Artificial Chromosome) PAC (P1-derived Artificial chromosome)
E.coli
E.coli E.coli
酵母细胞
哺乳类细胞 动物细胞 动物细胞 和细菌
粒pSC101连接成重
组质粒，具有双重抗 药性。
Stanley Cohen 1986 Nobel生理 或医学奖
Herb Boyer
三、基因工程大事记

1973 Cohen and Boyer第一例成功的克隆实验
1978 Genentech公司人胰岛素世界上第一种基因工程蛋白 药物

1982 第一个基因工程药物 --重组人胰岛素在英、美获准使
二、DNA转入的方法
就转基因技术而言，要将DNA转入鼠的基因组主要可
通过三种方法来实现：
利用反转录病毒载体将外源基因转入胚胎早期细胞，然后
移植到受体动物中；
利用显微注射法将DNA直接注射入受精卵的精前核中；
将基因工程改造过的胚胎干细胞导入早期胚胎中。
1、反转录病毒法
逆转录病毒侵染法是最早用来得到转基因小鼠的方法；
首先，向供体雌鼠注射怀孕母马的血清， 48 小时
后再注射人的绒毛膜促性腺激素，使其超量排卵， 增加用于微注射接种 DNA 的受精卵数量。经过处理 的雌鼠一次可以产生大约35个卵细胞，而正常雌鼠 一次只能产生5～10个卵细胞。
做载体，在细菌细胞里大量扩增。
5、感受态体系：1970年M.Mandel和A.Higa发现经氯化钙
处理的大肠杆菌容易吸收噬菌体的DNA。
6、DNA测序技术：1975年F.Sanger、A.Maxam和
W.Gibert发明了DNA快速测序技术
基因工程的诞生
R6-5
Boyer-Cohen 实验
将含有卡那霉素抗性 基因的大肠杆菌R6-5 质粒与含有四环素抗 性基因的大肠杆菌质
基 因 技 术 （ transgenic
technology 或
transgenesis）：整个转基因过程。
基因转变术（ Pharming ）：表示利用转基因家畜
在所产生的奶中生产人的药物蛋白这一想法。
转基因动物技术的应用：
（1）作为人类疾病的病理模型用于遗传病等疾病的 发病机理研究； （2）研究外源基因在整体动物中的表达调控规律； （3）作为药理学研究的动物模型用于寻找新的药物 作用靶点和新药筛选试验； （4）利用转基因动物如牛、羊、猪等的乳腺等组织 作为“生物反应器”生产极具药用价值的稀有 生物活性蛋白质。

转化 transformation
指质粒DNA或以它为载体构建的重组 DNA导入细菌的 过程。
转导
transduction
指以噬菌体为载体，在细菌之间转移 DNA 的过程，有 时也指在真核细胞之间通过逆转录病毒转移和获得细 胞DNA的过程。
转染
transfection
指病毒或以它为载体构建的重组子导入真核细胞的过
碱性磷酸酶
切除末端磷酸基
分子刀-DNA限制性内切酶
识别特定的核苷酸序列
4~6个碱基对 形成粘性末端或平端
4、载体（vector）
载体是运送目的基因片段进入宿主细胞的工具，能在宿主细
胞中进行自我复制和表达。
（1）能够自我复制，并带动插入的外源基因一起复制 （2）具有合适的限制性酶切位点 （3）具有合适的筛选标记 （4）细胞内拷贝数要多
（1）重组DNA技术的理论基础
19世纪中 孟德尔 豌豆杂交试验 遗传因子 经典遗传学
20世纪初 摩尔根 果蝇杂交实验 基因
1944年
基因学
艾弗瑞 肺炎双球菌转化实验 遗传物质DNA
分子遗传学
1953年 1973年 沃森-克瑞克 DNA双螺旋结构 分子生物学
科恩、博耶登 DNA分子体外拼接 基因工程
治疗遗传病 癌症等
部分重要的仪器设备
五、基因工程的基本定义
基因工程是指重组 DNA 技术的产业化设计与应用，包
括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的
是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组 DNA
技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大
规模培养以及基因产物的分离纯化过程。
1、基因工程内容
第五章
海洋动物基因工程
目 录
第一节 概述
第二节 转基因鼠的研究方法
第三节 转基因鱼
第一节 概述
一、基因工程诞生的理论基础 二、基因工程诞生的技术突破 三、基因工程大事记 四、基因工程主要操作内容 五、基因工程的基本定义
1、基因工程内容
2、基因工程技术
3、工具酶 4、载体 5、重组DNA技术
基因工程定义
环状
环状 环状 线性染色体
35- 45kb
≈300 kb
100 - 2000 kb
YAC (Yeast Artificial chromosome )
MAC (Mammalian Artificial Chromosome) 病毒载体 穿梭载体
100 - 2000 kb
〉 1000 kb SV40 载体，昆虫 杆状病毒载体 pSV选 *
外源基因导入
原核细胞
真核细胞
植物
发酵工程
转基因植物
转基因动物
提取产品、 药用蛋白等
作物改良、 提取产品等
畜禽改良 瘦肉型等 生长快等
流程图
（研究生班用）
PCR扩展
蛋白质
aa . 序列
探针
核酸序列
合成多肽
抗体
动物
人体
器官反应器
基因治疗
提取物 组织血 乳蛋等
在体外对不同生物的遗传物质（基因）进
行剪切、重组、连接，然后插入到载体分
子中（细菌质粒、病毒或噬菌体DNA），
转入微生物、植物或动物细胞内进行无性
繁殖，并表达出基因产物。
一、基因工程诞生的理论基础
1、DNA是遗传物质 2、DNA 的双螺旋结构和半保留复制 3、中心法则和遗传密码子 4、不同基因具有相同的物质基础 5、基因是可以切割的 6、基因是可以转移和重组的 7、遗传密码是通用的 8、基因可以通过复制把遗传信息传给下一代
线性染色体 环状 环状
5、重组DNA技术
重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基 因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生 物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并 表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称 为分子克隆技术。 因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三 大基本元件。
毒的复制功能序列，但是毒基因组可能与目的基
因一起整合到同一细胞核中，就可能大量复制病 毒，造成严重的污染，故不安全。此外，逆转录
病毒载体容量有限，只能转移小片段DNA
（≦10kb），而且逆转录病毒长末端重复的甲基
化状态常使转基因的表达缺失。
2、DNA显微注射法
目前培养转基因鼠的首选方法，操作步骤如下：
利用逆转录载体将遗传信息以 RNA分子的形式，在逆转录
整合酶和逆转录基因组末端的特异性核酸序列的作用下，反
转录并整合到宿主基因组中去，最终得到转基因小鼠。

逆转录病毒感染法特点： 优点：在各种转基因方法中，逆转录病毒感染
法的转基因效率是最高的，且为单拷贝随机整合。
缺点：逆转录病毒载体在设计时虽然缺失了病
程。
筛 选 克 隆
第二节 转基因鼠的研究方法
一、概述 二、DNA转入的方法
1、反转录病毒法
2、DNA显微注射法 3、胚胎干细胞法
一、概述
转基因动物技术始于80年代初， 1982年世界上首
个转基因小鼠诞生，从此揭开了转基因动物研究的
新篇章。
通过转基因技术可以人为改造动物基因组，并在动
物整体水平上研究有关基因的功能。
目前 , 已先后建立了许多整合有外源基因的转基因
小鼠和大鼠，转基因鱼、兔、猪、羊、牛等也已诞 生。
转基因动物（ transgenic
animal）：就是指以实
验方法将外源基因导入动物染色体基因组内稳定整
合并能遗传给后代的一类动物。
转入基因（transgene）：导入的基因称为转入基
因。
转
二、基因工程诞生的技术突破
1、琼脂糖凝胶电泳：1960年发明了琼脂糖凝胶电泳，可
将不同长度的DNA分离开来
2、DNA连接酶：1967年三个实验室几乎同时发现了DNA
连接酶。
3、限制性内切酶：1970年H.O.Smith分离出第一种限制性
内切酶.
4、载体：1972年前后使用小分子量的细菌质粒和λ噬菌体
中。（转）
4、扩增DNA重组分子：短时间培养转化细胞，以扩增DNA
分子或使其整合到受体细胞的DNA分子中。（增）
5、筛选的转化细胞：获得使外源基因高效稳定表达的基因工
程菌或细胞。（检）
基因工程操作流程
基因工程流程模式图
生物材料
组织、器官、细胞
合成DNA
基因组
mRNA
特异DNA片段
DNA片段
cDNA 构建载体
四、基因工程主要操作内容
1、目的基因的获取：从复杂的生物基因组中，经过酶切消化
和PCR扩增等步骤，分理处带有目的基因的DNA片段。（切）
2、重组体的制备：将目的基因的DNA片段插入到能自我复制
并带有选择性标记的（抗菌素的抗性）载体分子上，形成DNA 重组分子。（接）
3、重组体的转化：经过重组体（载体）载入适当的受体细胞Leabharlann 上游技术（upstream）


重组子的构建
工程菌的构建及高效表达

下游技术（downstream）


工程菌大规模发酵最佳参数的确定
新型生物反应器的研制 高效分离介质及装置的开发 分离纯化的优化控制 生物反应器等一系列仪器、仪表的设计制造 超滤、反渗透技术的应用
2、基因工程技术