猪圆环病毒 型疫苗及其生产方法
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3）病毒培养24～36小时后，弃去细胞维持液，用缓冲溶液冲洗传代细胞，加入孵育剂孵育30～45分钟，弃 去孵育剂，用缓冲溶液冲洗传代细胞，加入细胞维持液继续培养；
4）收获培养液，经细胞破碎处理，获得猪圆环病毒Ⅱ型病毒液。
5）病毒液加入灭活剂，灭活后加入佐剂、乳化剂，制得猪圆环病毒Ⅱ型疫苗。
优选地，该发明所述的生物反应器为微载体悬浮培养生物反应器。更优选地，该发明所述的生物反应器为潮 汐式微载体悬浮培养生物反应器。
（2）生产规模大、单批次产量高：2010年9月前中国国内采用搅拌式悬浮培养工艺培养动物细胞，单台生物 反应器最大规模不超过100升；而该发明采用新的技术参数，运用潮汐式微载体悬浮培养技术培养动物细胞，单 台生物反应器规模达500升，最大可达1000升，单台规模提高5-10倍。
（3）连续式封闭式生产、收获病毒：该发明的方法可以全封闭生产，自动换液，连续收获方式收集病毒液， 减少了污染的机率，产品质量均一稳定，批间差异小。解决了传统工艺仅能控制温度和转速，不同批次质量差异 大、批间差异大的问题。该发明方法，可直接线性放大用于生产。
2014年11月6日，《猪圆环病毒Ⅱ型疫苗及其生产方法》获得第十六届中国专利优秀奖。
（概述图为《猪圆环病毒Ⅱ型疫苗及其生产方法》摘要附图 ）
专利背景
猪圆环病毒Ⅱ型（简称PCV2）感染引起的断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）、猪呼吸疾病综合征（PRDC）、 猪皮肤和肾病综合征（PDNS）等多种疾病（总称为猪圆环病毒病，PCVDs），其临床特征为体重逐渐减轻，以及 体征例如呼吸急促、呼吸困难和黄疸。从病理学观点来看，其表现为淋巴细胞或肉芽肿浸润，淋巴结病以及较罕 见的肝炎和淋巴细胞或肉芽肿性肾炎。（ClarkE.G.（1997）.SwineP rac.499-501；La Semaine Veterinaire No.26，supplement to La Semaine Veterinaire1996（834）；La Semaine Veterinaire1997（857）：54；Nayar等人（1997）Can.V et.J.38：385-387）。该病最早于1991年在加拿大 西部发现（Clark EG.Post-weaning multisystemic wasting syndrome.Proc Am AssocS wine Pract， 1997，28：499-501），随后，该疾病相继在美国、法国、西班牙、北爱尔兰等国或地区出现（Daft B 等.Interstitial pneumonia and lymphadenophathy associated with circoviral infection in a sixweek-old pig.Proc Am Assoc Yet Lab Diag，1996，39：32；Kennedy S等.Porcine circovirus infection in Northern Ireland.vet Rec，1998，142：495并96；LeCann P等.Piglet wasting disease.Tlet Rec，1997，141：660；SegalesJ等.First report of post-weaning multisystemic wasting syndrome in pigs in Spain.Vet Rec，1997，141：600-660）。在中国国内，郎洪武等（郎洪武等. 断奶猪多系统衰弱综合征血清抗体检测.中国兽医科技，2000，30：3-5）和曹胜波等（曹胜波等.猪Ⅱ型圆环病 毒豫A株的全基因组克隆与序列分析.病毒学报，2000，18：137-141）分别通过血清学和病原学调查表明，中国 已有PCV2的流行。2010年9月前，PCV2已在世界各地广泛存在并流行，给全球养猪业造成了相当大的经济损失。
《猪圆环病毒Ⅱ型疫苗及其生产方法》包括如下技术步骤：（1）制苗用细胞高密度培养；（2）制苗毒液的 繁殖；（3）加入佐剂制备灭活疫苗。与2010年9月前已有技术相比，该发明具有病毒产量高、毒价高、生产规模 大、单批次产量高、生产成本相对较低、产品质量高且稳定等优点。该发明灭活疫苗具有较好安全性，并可以诱 导猪体产生免疫保护效果，完全符合国家兽医生物制品标准。
猪圆环病毒 型疫苗及其生产方法
专利
01 专利背景
03 附图说明 05 实施方式
目录
02 发明内容 04 权利要求 06 荣誉表彰
《猪圆环病毒Ⅱ型疫苗及其生产方法》是洛阳普莱柯生物工程有限公司于2010年9月3日申请的发明专利，该 专利的申请号为52，公布号为CNA，公布日为2011年1月5日，发明人是张许科、孙进忠、乔荣岑，该专利属于生 物制品技术领域。
实施方式
实施例1潮汐式微载体悬浮生物反应器大规模生产猪圆环病毒Ⅱ型（PCV2）
该实施例中所使用的生物反应器为潮汐式微载体生物反应器，所使用的微载体为聚酯纤维。宽5毫米，长10 毫米，1克载体提供2,400平方厘米的贴壁面积，可提供1.0×109以上数量的细胞生长。
（1）将PK15细胞3.2×1010cells接种于20升载体罐中并添加载体聚酯纤维1600克，以及工作体积为500升 的含6％牛血清的DMEM生长用培养液，潮汐式微载体悬浮培养技术培养至细胞总数达到1.28×1012cells；培养 细胞时先启动贴附程序，4小时后换成培养程序；细胞贴附程序为：Up：2500毫升/分钟；Hold1分钟；Down： 2500毫升/分钟；Hold30秒，设定最大换液量18.5升；细胞培养程序：Up：1900毫升/分钟；Hold1分钟； Down1900毫升/分钟；Hold1分钟，设定最大换液量18升。
（2）将细胞生长用培养液全部更换为含2％牛血清的维持用DMEM培养液，并同步（M.O.I.＝0.1）加入猪圆 环病毒Ⅱ型（PCV2），于37℃培养，控制二氧化碳浓度5％，pH值7.2；接种病毒时先启动病毒吸附程序，4小时 后换成病毒培养程序；病毒吸附程序为：Up：1600毫升/分钟；Hold1分钟；Down：1600毫升/分钟；Hold30秒、 设定最大换液量18.5升；病毒培养程序：Up：1000毫升/分钟；Hold1分钟；Down1000毫升/分钟；Hold1分钟、 设定最大换液量18升。
荣誉表彰
2014年11月6日，《猪圆环病毒Ⅱ型疫苗及其生产方法》获得第十六届中国专利优秀奖。
谢谢观看
发明内容
技术方案
改善效果
《猪圆环病毒Ⅱ型疫苗及其生产方法》包括如下步骤：
1）微载体生物反应器中，微载体密度为60～80克/升，每克载体加入1.4×107～2.6×107个传代细胞及细 胞生长液，启动细胞吸附程序使微载体与传代细胞充分结合后，启动细胞培养程序，培养传代细胞；
2）上述传代细胞培养至5.0×109cells/升～8×1010cells/升时换用细胞维持液，按照感染复数为M.O.I. ＝0.001～1接种猪圆环病毒Ⅱ型，启动病毒吸附程序，使病毒与传代细胞充分接触，换用病毒培养程序，扩增培 养猪圆环病毒Ⅱ型；
附图说明
图1为细胞接种0天时微载体上的显微照片； 图2为病毒接种5天时微载体上的显微照片； 图3为病毒接种10天时微载体上的显微照片； 图4为潮汐式微载体悬浮培养生物反猪圆环病毒Ⅱ型疫苗及其生产方法》其特征在于，包括如下步骤： 1）微载体生物反应器中，微载体密度为60～80克/升，每克载体加入1.4×107～2.6×107个传代细胞及细 胞生长液，启动细胞吸附程序使微载体与传代细胞充分结合后，启动细胞培养程序，培养传代细胞； 2）上述传代细胞培养至5.0×109cells/升～8.0×1010cells/升时换用细胞维持液，按照感染复数为M.O.I. ＝0.001～1接种猪圆环病毒Ⅱ型，启动病毒吸附程序，使病毒与传代细胞充分接触，换用病毒培养程序，扩增培 养猪圆环病毒Ⅱ型； 3）病毒培养24～36小时后，弃去细胞维持液，用缓冲溶液冲洗传代细胞，加入孵育剂孵育30～45分钟，弃 去孵育剂，用缓冲溶液冲洗传代细胞，加入细胞维持液继续培养； 4）收获培养液，经细胞破碎处理，获得猪圆环病毒Ⅱ型病毒液； 5）病毒液加入灭活剂，灭活后加入佐剂、乳化剂，制得猪圆环病毒Ⅱ型疫苗。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物反应器为微载体悬浮培养生物反应器。 3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物反应器为为潮汐式微载体悬浮培养生物反应器。
（4）生产成本相对较低、产品质量高且稳定：传统转瓶生产工艺生产的PCV2病毒毒价仅为104.0TCID50/毫 升，要达到兽用生物制品规程要求的105.0TCID50/毫升，需要进行浓缩处理，每毫升的生产成本为3元，而该发 明工艺生产的PCV2病毒毒价平均可达106.5TCID50/毫升，每毫升的生产成本为0.5元，产品成本下降6倍，质量 提高提高100倍（以毒价计）。不同培养系统增殖猪圆环病毒比较结果见表1。
优选地，该发明所述的微载体为球形、状或片状微载体。
与2010年9月前已有技术相比，该发明的猪圆环病毒Ⅱ型疫苗的生产方法，具有以下有益效果：
（1）毒价高：传统的转瓶工艺生产的PCV2病毒毒价仅为104.0TCID50/毫升，而该发明采用新的技术参数， 运用潮汐式微载体悬浮培养技术高密度培养生产的病毒毒价可以达到106.0TCID50/毫升～107.0TCID50/毫升， 其毒价要高出100-1000倍。
4）收获培养液，经细胞破碎处理，获得猪圆环病毒Ⅱ型病毒液。
5）病毒液加入灭活剂，灭活后加入佐剂、乳化剂，制得猪圆环病毒Ⅱ型疫苗。
优选地，该发明所述的生物反应器为微载体悬浮培养生物反应器。更优选地，该发明所述的生物反应器为潮 汐式微载体悬浮培养生物反应器。
（2）生产规模大、单批次产量高：2010年9月前中国国内采用搅拌式悬浮培养工艺培养动物细胞，单台生物 反应器最大规模不超过100升；而该发明采用新的技术参数，运用潮汐式微载体悬浮培养技术培养动物细胞，单 台生物反应器规模达500升，最大可达1000升，单台规模提高5-10倍。
（3）连续式封闭式生产、收获病毒：该发明的方法可以全封闭生产，自动换液，连续收获方式收集病毒液， 减少了污染的机率，产品质量均一稳定，批间差异小。解决了传统工艺仅能控制温度和转速，不同批次质量差异 大、批间差异大的问题。该发明方法，可直接线性放大用于生产。
2014年11月6日，《猪圆环病毒Ⅱ型疫苗及其生产方法》获得第十六届中国专利优秀奖。
（概述图为《猪圆环病毒Ⅱ型疫苗及其生产方法》摘要附图 ）
专利背景
猪圆环病毒Ⅱ型（简称PCV2）感染引起的断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）、猪呼吸疾病综合征（PRDC）、 猪皮肤和肾病综合征（PDNS）等多种疾病（总称为猪圆环病毒病，PCVDs），其临床特征为体重逐渐减轻，以及 体征例如呼吸急促、呼吸困难和黄疸。从病理学观点来看，其表现为淋巴细胞或肉芽肿浸润，淋巴结病以及较罕 见的肝炎和淋巴细胞或肉芽肿性肾炎。（ClarkE.G.（1997）.SwineP rac.499-501；La Semaine Veterinaire No.26，supplement to La Semaine Veterinaire1996（834）；La Semaine Veterinaire1997（857）：54；Nayar等人（1997）Can.V et.J.38：385-387）。该病最早于1991年在加拿大 西部发现（Clark EG.Post-weaning multisystemic wasting syndrome.Proc Am AssocS wine Pract， 1997，28：499-501），随后，该疾病相继在美国、法国、西班牙、北爱尔兰等国或地区出现（Daft B 等.Interstitial pneumonia and lymphadenophathy associated with circoviral infection in a sixweek-old pig.Proc Am Assoc Yet Lab Diag，1996，39：32；Kennedy S等.Porcine circovirus infection in Northern Ireland.vet Rec，1998，142：495并96；LeCann P等.Piglet wasting disease.Tlet Rec，1997，141：660；SegalesJ等.First report of post-weaning multisystemic wasting syndrome in pigs in Spain.Vet Rec，1997，141：600-660）。在中国国内，郎洪武等（郎洪武等. 断奶猪多系统衰弱综合征血清抗体检测.中国兽医科技，2000，30：3-5）和曹胜波等（曹胜波等.猪Ⅱ型圆环病 毒豫A株的全基因组克隆与序列分析.病毒学报，2000，18：137-141）分别通过血清学和病原学调查表明，中国 已有PCV2的流行。2010年9月前，PCV2已在世界各地广泛存在并流行，给全球养猪业造成了相当大的经济损失。
《猪圆环病毒Ⅱ型疫苗及其生产方法》包括如下技术步骤：（1）制苗用细胞高密度培养；（2）制苗毒液的 繁殖；（3）加入佐剂制备灭活疫苗。与2010年9月前已有技术相比，该发明具有病毒产量高、毒价高、生产规模 大、单批次产量高、生产成本相对较低、产品质量高且稳定等优点。该发明灭活疫苗具有较好安全性，并可以诱 导猪体产生免疫保护效果，完全符合国家兽医生物制品标准。
猪圆环病毒 型疫苗及其生产方法
专利
01 专利背景
03 附图说明 05 实施方式
目录
02 发明内容 04 权利要求 06 荣誉表彰
《猪圆环病毒Ⅱ型疫苗及其生产方法》是洛阳普莱柯生物工程有限公司于2010年9月3日申请的发明专利，该 专利的申请号为52，公布号为CNA，公布日为2011年1月5日，发明人是张许科、孙进忠、乔荣岑，该专利属于生 物制品技术领域。
实施方式
实施例1潮汐式微载体悬浮生物反应器大规模生产猪圆环病毒Ⅱ型（PCV2）
该实施例中所使用的生物反应器为潮汐式微载体生物反应器，所使用的微载体为聚酯纤维。宽5毫米，长10 毫米，1克载体提供2,400平方厘米的贴壁面积，可提供1.0×109以上数量的细胞生长。
（1）将PK15细胞3.2×1010cells接种于20升载体罐中并添加载体聚酯纤维1600克，以及工作体积为500升 的含6％牛血清的DMEM生长用培养液，潮汐式微载体悬浮培养技术培养至细胞总数达到1.28×1012cells；培养 细胞时先启动贴附程序，4小时后换成培养程序；细胞贴附程序为：Up：2500毫升/分钟；Hold1分钟；Down： 2500毫升/分钟；Hold30秒，设定最大换液量18.5升；细胞培养程序：Up：1900毫升/分钟；Hold1分钟； Down1900毫升/分钟；Hold1分钟，设定最大换液量18升。
（2）将细胞生长用培养液全部更换为含2％牛血清的维持用DMEM培养液，并同步（M.O.I.＝0.1）加入猪圆 环病毒Ⅱ型（PCV2），于37℃培养，控制二氧化碳浓度5％，pH值7.2；接种病毒时先启动病毒吸附程序，4小时 后换成病毒培养程序；病毒吸附程序为：Up：1600毫升/分钟；Hold1分钟；Down：1600毫升/分钟；Hold30秒、 设定最大换液量18.5升；病毒培养程序：Up：1000毫升/分钟；Hold1分钟；Down1000毫升/分钟；Hold1分钟、 设定最大换液量18升。
荣誉表彰
2014年11月6日，《猪圆环病毒Ⅱ型疫苗及其生产方法》获得第十六届中国专利优秀奖。
谢谢观看
发明内容
技术方案
改善效果
《猪圆环病毒Ⅱ型疫苗及其生产方法》包括如下步骤：
1）微载体生物反应器中，微载体密度为60～80克/升，每克载体加入1.4×107～2.6×107个传代细胞及细 胞生长液，启动细胞吸附程序使微载体与传代细胞充分结合后，启动细胞培养程序，培养传代细胞；
2）上述传代细胞培养至5.0×109cells/升～8×1010cells/升时换用细胞维持液，按照感染复数为M.O.I. ＝0.001～1接种猪圆环病毒Ⅱ型，启动病毒吸附程序，使病毒与传代细胞充分接触，换用病毒培养程序，扩增培 养猪圆环病毒Ⅱ型；
附图说明
图1为细胞接种0天时微载体上的显微照片； 图2为病毒接种5天时微载体上的显微照片； 图3为病毒接种10天时微载体上的显微照片； 图4为潮汐式微载体悬浮培养生物反猪圆环病毒Ⅱ型疫苗及其生产方法》其特征在于，包括如下步骤： 1）微载体生物反应器中，微载体密度为60～80克/升，每克载体加入1.4×107～2.6×107个传代细胞及细 胞生长液，启动细胞吸附程序使微载体与传代细胞充分结合后，启动细胞培养程序，培养传代细胞； 2）上述传代细胞培养至5.0×109cells/升～8.0×1010cells/升时换用细胞维持液，按照感染复数为M.O.I. ＝0.001～1接种猪圆环病毒Ⅱ型，启动病毒吸附程序，使病毒与传代细胞充分接触，换用病毒培养程序，扩增培 养猪圆环病毒Ⅱ型； 3）病毒培养24～36小时后，弃去细胞维持液，用缓冲溶液冲洗传代细胞，加入孵育剂孵育30～45分钟，弃 去孵育剂，用缓冲溶液冲洗传代细胞，加入细胞维持液继续培养； 4）收获培养液，经细胞破碎处理，获得猪圆环病毒Ⅱ型病毒液； 5）病毒液加入灭活剂，灭活后加入佐剂、乳化剂，制得猪圆环病毒Ⅱ型疫苗。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物反应器为微载体悬浮培养生物反应器。 3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物反应器为为潮汐式微载体悬浮培养生物反应器。
（4）生产成本相对较低、产品质量高且稳定：传统转瓶生产工艺生产的PCV2病毒毒价仅为104.0TCID50/毫 升，要达到兽用生物制品规程要求的105.0TCID50/毫升，需要进行浓缩处理，每毫升的生产成本为3元，而该发 明工艺生产的PCV2病毒毒价平均可达106.5TCID50/毫升，每毫升的生产成本为0.5元，产品成本下降6倍，质量 提高提高100倍（以毒价计）。不同培养系统增殖猪圆环病毒比较结果见表1。
优选地，该发明所述的微载体为球形、状或片状微载体。
与2010年9月前已有技术相比，该发明的猪圆环病毒Ⅱ型疫苗的生产方法，具有以下有益效果：
（1）毒价高：传统的转瓶工艺生产的PCV2病毒毒价仅为104.0TCID50/毫升，而该发明采用新的技术参数， 运用潮汐式微载体悬浮培养技术高密度培养生产的病毒毒价可以达到106.0TCID50/毫升～107.0TCID50/毫升， 其毒价要高出100-1000倍。