氦氧机械通气联合乌司他丁对兔急性肺损伤的保护作用

氦氧机械通气联合乌司他丁对兔急性肺损伤的保护作用
陈冬梅;朱帅俊;吴文伟;翁钦永
【摘要】目的探讨氦氧机械通气联合乌司他丁对盐酸诱导兔急性肺损伤(ALI)的影响.方法将40只健康新西兰兔子随机分为生理盐水对照组(N组)、ALI模型组(M 组)、氦氧机械通气治疗组(H组)、乌司他丁治疗组(U组)和氦氧机械通气联合乌司他丁治疗组(H+U组)各8只.5组均给予气管切开、机械通气,除了N组外,余各组均气管内滴注盐酸建立ALI模型.模型建立后,N、M组腹腔注射生理盐水,调整吸入氧浓度(FiO2)为50％;H组给予氦氧通气、腹腔注射生理盐水;U组腹腔注射乌司他丁,调整FiO2为50％;H+U组给予氦氧通气、腹腔注射乌司他丁.于气管插管后即刻、模型建立后即刻、治疗后4h记录各组兔子的气道峰压、胸肺总顺应性及PaO2.治疗4h后处死兔子,在光学显微镜下观察肺组织的病理学改变,检测肺组织髓过氧化物酶(MPO)含量及细胞凋亡指数(AI).结果 (1)5组间气道峰压比较,差异有统计学意义(P＜0.05),治疗4h后H组及H+U组的气道峰压较前明显降低,且均低于其余3组.(2)5组间胸肺总顺应性比较,差异有统计学意义(P＜0.05),治疗后4hH组及H+U组的胸肺总顺应性较前升高,且均高于其余3组.(3)5组间PaO2比较,差异有统计学意义(P＜0.05),治疗后4hM组、H组明显低于N组,但U组及U+H组接近N组水平.(4)治疗4h后,其余4组MPO水平均高于N组(P＜0.05),U组和
H+U组的MPO活性较M组和H组明显降低(P＜0.05).(5)M组和H组的AI均高于N组(P＜0.05),M组和H组间比较,差异无统计学意义(P＞0.05);而U组和H+U 组的AI均低于M组及H组(P＜0.05),U组和H+U组间比较,差异无统计学意义(P ＞0.05).结论氦氧机械通气联合乌司他丁能够通过降低气道峰压、改善氧合及胸肺总顺应性、抑制炎性细胞聚集及激活、减少肺组织细胞凋亡等途径对盐酸诱导的兔急性肺损伤有一定的保护作用.%Objective To investigate the effect of helium-
oxygen mechanical ventilation combined with ulinastatin on rabbits with acute lung injury(ALI) induced by hydrochloric acid.Methods A total of 40 healthy New Zealand rabbits were randomly divided into saline control group (Group N),ALI model group (Group M),helium-oxygen mechanical ventilation group (Group H),ulinastatin group (Group U) and helium-oxygen mechanical ventilation combined with ulinastatin group(Group H + U),with 8 rabbits in each group.Tracheotomy and mechanical ventilation were conducted in 5 groups.ALI models were established by intra-tracheal instillation of hydrochloric acid solution in the other groups except Group N.After modeling,intraperitoneal injection with normal saline was conducted and fraction of inspired oxygen (FiO2) was adjusted to 50％ in Group N and Group M.Helium-oxygen mechanical ventilation and intraperitoneal injection with normal saline were conducted in Group
H.Intraperitoneal injection with ulinastatin was conducted and FiO2 was adjusted to 50％ in Group U.Helium-oxygen mechanical ventilation and intraperitoneal injection with ulinastatin were conducted in Group H + U.The airway peak pressure,lung-thorax compliance and PaO2 of recorded at the instant of tracheal intubation completion,at the instant of model completion and after 4 hours of treatment in all groups.The rabbits were executed after 4 hour of treatment,then the pathological change of lung tissue was observed under light microscope,myeloperoxidase(MPO) conte nt and apoptosis index(AI) of lung tissue were detected.Results ① There was significant difference in the airway peak pressure among 5 groups(P ＜ 0.05).After 4 hours of treatment,the airway peak pressures of
Group H and Group H + U decreased significantly compared to those before treatment,and were lower than that of the other three groups.② There was significant difference in the lung-thorax compliance among 5 groups (P ＜ 0.05).After 4 hours of treatment,the lung-thorax compliance of Group H and Group H + U increased compared to those before treatment,and was higher than that of the other three groups.③ There was significant difference in PaO2 among 5 groups (P ＜ 0.05).After 4 hours of treatment,PaO2 of Group M and Group H was significantly lower than that of Group N,but PaO2 of Group U and Group U + H was close to the level of Group N.④ After 4 hours of treatment,the MPO activation of the other 4 groups was higher than that of Group N (P ＜ 0.05),the MPO activation of Group U and Group H + U was significantly lower than that of Group M and Group H(P ＜0.05).⑤ AI of Group M and Group H was higher than that of Group N(P ＜0.05),But there was no significant difference between Group M and Group H(P ＞0.05).AI of Group U and Group H +U was lower than that of Group N and Group H(P ＜0.05),and there was no significant difference between Group U and Group H + U (P ＞ 0.05).Conclusion Helium-oxygen mechanical ventilation combined with ulinastatin has protective effect on rabbits with ALI induced by hydrochloric acid through decreasing the airway peak pressure,improving oxygenation and lung-thorax compliance,inhibiting aggregation and activation of inflammation cells and reducing cell apoptosis of lung tissue.
【期刊名称】《广西医学》
【年(卷),期】2017(039)004
【总页数】5页(P508-512)
【关键词】急性肺损伤;乌司他丁;氦氧混合气;机械通气;盐酸;兔
【作者】陈冬梅;朱帅俊;吴文伟;翁钦永
【作者单位】福建医科大学附属协和医院重症医学科,福州市350001;福建医科大
学附属协和医院重症医学科,福州市350001;福建医科大学附属协和医院重症医学科,福州市350001;福建医科大学附属协和医院重症医学科,福州市350001
【正文语种】中文
【中图分类】R563.8
氦气是一种小分子的惰性气体，结构稳定，具有低密度、高运动黏性系数的特点，在相同条件下，氦气的流速是空气的2.68倍，氦气与氧气混合形成的氦氧混合气
同样具有密度低、运动黏性高的特点[1]。

研究表明，氦氧混合气具有减低气流在
气道中的阻力、降低气道压、增大吸气流速和呼气流速、促进氧气向肺泡弥散及二氧化碳的排除等优点[2]，临床上已经将其应用于急性重症哮喘、慢性阻塞性肺部
疾病、支气管炎等病的治疗[3]，且氦氧机械通气对急性肺损伤(acute lung injury，ALI)者的肺组织也有一定的保护作用[4]。

乌司他丁作为一种蛋白酶抑制剂，除对
多种蛋白酶、脂水解酶等有抑制作用外，还具有清除氧自由基、抑制炎症介质的过度释放等功能[5]。

动物实验表明乌司他丁对脂多糖、烧伤及缺血再灌注导致的肺
损伤具有保护作用[6-7]。

但是否能减轻盐酸所致的肺损伤尚未见报道。

本研究旨
在探讨氦氧机械通气联合乌司他丁对盐酸诱导的急性肺损伤兔模型的肺保护作用，为临床防治ALI提供理论参考。

1.1 实验动物及分组健康新西兰家兔40只，雌雄不限，体质量(
2.5±0.3)kg，由
上海市松江区松联实验动物场提供(许可证号：2007001102092)。

采用随机数字
表法随机分为阴性对照组(N组)、ALI模型组(M组)、氦氧机械通气治疗组(H组)、乌司他丁治疗组(U组)和氦氧机械通气联合乌司他丁治疗组(H+U组)，每组8只。

1.2 主要仪器与试剂 >99.999%氦气(深圳空气化工产品气体有限公司)；DHX-150动物呼吸机(成都仪器厂)；氧浓度测量仪(MSA公司)；AVL血气自动分析仪(德国OMNI公司)；DNA断裂的原位末端标记[terminal deoxynucleotidyl transferase(TdT)-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL]试剂盒(Roche
公司)；乌拉坦(成都贝斯特试剂有限公司)；髓过氧化物酶( myeloperoxidase，MPO)试剂盒(南京建成生物工程研究所)；乌司他丁(规格：10万U；批号：031301103；广东天普生化医药公司)。

1.3 机械通气气体的准备氦氧通气时将氧气和氦气用三通管连接至动物呼吸机的
气体输入端，并在出气端连接吸入氧浓度(fraction of inspired oxygen，FiO2)测量仪，调整氧气和氦气的流速，控制FiO2为50%；氮氧通气时三通管一端接着
氧气，一端和大气相通，调整氧气流速控制FiO2为50%。

1.4 模型制作予20%乌拉坦(9 ml/kg)耳缘静脉注射麻醉新西兰兔，待角膜反射消失后取仰卧位置于实验台上并固定头与四肢，切开颈部皮肤，逐层分离组织至右颈动脉，行右颈动脉置管术，插入24 G动脉套管针，经此抽取动脉血标本，随后分离气管，行气管切开术，置入3.5号气管导管，静脉滴注顺阿曲库铵0.2 mg/kg，待自主呼吸消失后接动物呼吸机行机械通气，呼吸机参数设置为容控模式，呼吸频率30次/min，潮气量8 ml/kg，吸呼比为1 ∶1，FiO2 21%。

待稳定后参照Nader等[8]介绍的方法并加以改进，制作盐酸吸入性ALI模型，具体如下：M组、H组、U组、H+U组经气管套管向气管内匀速注入pH 1.0的稀盐酸2 ml/kg，
滴注时间为5 min，滴注过程中先保持右侧体位2.5 min，然后转为左侧体位2.5
min，然后转为仰卧位。

稀盐酸滴注完毕30 min后，经颈动脉抽血，行血气分析，当氧合指数(PaO2/FiO2)<300时，提示ALI模型建立成功。

N组仅进行气管切开并机械通气。

模型建立后，N、M组调整FiO2为50%，腹腔注射生理盐水5
ml/kg；H组给予氦氧通气(FiO250%)，腹腔注射生理盐水5 ml/kg；U组调整FiO2为50%，腹腔注射乌司他丁10万U/kg(1支乌司他丁溶入5 ml生理盐水配制成2万U/ml乌司他丁注射液)；H+U组给予氦氧通气(FiO2 50%)，腹腔注射
乌司他丁10万U/kg。

1.5 观察指标
1.5.1 气道峰压、胸肺总顺应性及动脉血氧分压(PaO2)：分别以气管插管后即刻、模型建立后即刻、治疗4 h后为时间点，记录各实验组气道峰压、胸肺总顺应性、PaO2。

1.5.2 肺组织病理学观察：治疗4 h后处死动物，快速开胸，取左右双肺固定3个位置肺组织，置于4%甲醛溶液中固定，石蜡包埋后切片备用，右肺下叶制备10%肺组织匀浆置于-70℃冰箱保存备用。

标本切片并行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining，HE)染色，光学显微镜下观察肺组织病理学改变。

1.5.3 TUNEL法检测细胞凋亡指数：采用TUNEL法检测细胞凋亡指数(apoptosis index，AI)，按照细胞凋亡试剂盒说明书处理切片。

处理后，每张切片于目镜下随机取5个视野，每组共25个视野，每个视野计数1 000个以上肺上皮、内皮细胞数，阳性细胞表现为细胞核呈棕黄色染色，部分胞浆也可因胞核的破裂而呈阳性染色，换算成AI，AI=视野内的阳性细胞数/视野内总细胞数×100%。

取正常兔肺组织标本作为阴性对照。

1.5.4 MPO活性测定：肺组织匀浆MPO活性检测严格按照MPO测试盒说明进行。

1.6 统计学分析应用SPSS 16.0软件进行统计学分析，计量资料采用(x±s)表示，
多组均数比较采用方差分析，采用SNK-q检验进行两两比较，重复测量资料比较
采用重复测量方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2.1 气道峰压及胸肺总顺应性观察结果 (1)5组间气道峰压比较，差异有统计学意
义(F组间=20.158，P组间=0.027)，其中，模型建立后即刻其余4组的气道峰压均高于N组，而在治疗后4 h时H组及H+U组的气道峰压均低于其余3组。

各
组在不同时间点的气道峰压比较，差异均有统计学意义(F时间=18.258，P时间
=0.032)，其中N组及M组的气道峰压随观察时间延长而升高，U组、H组及
H+U组在模型建立后即刻明显升高，治疗后4 h H组及H+U组较前明显降低。

组间与时间有交互效应(F交互=32.524，P交互=0.006)。

见表1。

(2)5组间胸肺
总顺应性比较，差异有统计学意义(F组间=386.580，P组间<0.001)，其中，模
型建立后即刻其余4组的胸肺总顺应性均低于N组，而治疗后4 h H组及H+U
组的胸肺总顺应性均高于其余3组。

各组在不同时间点的胸肺总顺应性比较，差
异均有统计学意义(F时间=23.820，P时间=0.025)，其中N组及M组的胸肺总
顺应性随观察时间延长而降低，U组、H组及H+U组在模型建立后即刻明显降低，治疗后4 h H组及H+U组较前明显升高。

组间与时间有交互效应( F交互
=37.230，P交互=0.005)。

见表2。

2.2 动脉血气分析及MPO活性 (1)5组间PaO2比较，差异有统计学意义(F组间
=196.811，P组间<0.001)，模型建立后即刻其余4组的PaO2均明显低于N组，治疗后4 h M组、H组仍明显低于N组，但U组及U+H组接近N组水平。

各组在不同时间点的PaO2比较，差异均有统计学意义(F时间=345.368，P时间
<0.001)，5组的PaO2在模型建立后即刻明显降低，治疗后4 h较前升高。

组间与时间有交互效应(F交互=53.769，P交互<0.001)。

见表3。

(2)治疗4 h后，其余4组MPO活性均高于N组(P<0.05)，U组和H+U组的MPO活性较M组和
H组明显降低(P<0.05)，而U组和H+U组间、M组和H组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

见表4。

2.3 光学显微镜结果 N组肺泡大小均匀，结构完整，肺泡壁薄，肺泡间隔血管无
充血，肺泡腔及间隙内未见出血、水肿及中性粒细胞浸润，见图1a；M组肺泡大量塌陷，未充分扩张，肺泡隔增宽，血管充血，可见较多中性粒细胞，肺泡腔内大量出血及炎性渗出，见图1b；U组肺泡塌陷，肺泡间隔增宽，血管未见明显充血，可见少量中性粒细胞浸润，肺泡腔内可见少许红细胞及炎性渗出液，见图1c；H
组气管周围的肺泡塌陷，肺泡间隔增宽，血管未见明显充血，未见明显中性粒细胞，小部分肺泡区域内可见红细胞及炎性渗出，见图1d。

H+U组气管周围的肺泡塌陷，肺泡间隔增宽，血管未见明显充血，未见明显中性粒细胞，小部分肺泡区域内可见红细胞及炎性渗出，见图1e。

2.4 肺组织细胞 N组仅有少量TUNEL阳性细胞表达，呈散在分布。

M组和H组TUNEL阳性细胞表达较N组明显增多，且两组的AI均高于N组(P<0.05)，但M 组及H组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

而U组和H+U组TUNEL阳性细胞表达较M组和H组明显减少。

两组的AI均低于M组和H组(P<0.05)，U组和
H+U组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

U组和H+U组与N组比较，差异亦无统计学意义(P>0.05)。

见图2及表5。

ALI是临床上常见的危重病，系物理、化学、生物等损伤因素导致单核巨噬细胞及中性粒细胞等的活化和积聚，释放MPO、氧自由基及多种炎性细胞因子，使血管内皮通透性增加，导致肺血管周围和肺泡内水肿和出血，进而出现气道阻塞，最终加重肺部炎性反应[9]。

目前ALI的治疗主要集中在减轻肺水肿，包括使用糖皮质
激素、一氧化氮、抗氧化剂等，但效果均不理想。

有研究表明氦氧通气对ALI有
一定的保护作用，但对肺组织的凋亡率无明显改善[10]。

而乌司他丁作为一种蛋白酶抑制剂，能够改善炎症反应，但对呼吸力学无特殊作用。

氦氧通气联合乌司他丁治疗急性肺损伤尚未有报道，本研究旨在探讨氦氧通气联合乌司他丁对盐酸诱导的ALI兔模型气道峰压、胸肺总顺应性、氧分压、肺组织病理、MPO活性及肺组织
凋亡率的影响。

本研究结果显示，与N组比较，在模型建立后即刻其余4组的气道峰压均升高，
而胸肺总顺应性降低；而治疗后4 h，H组及H+U组的气道峰压较前降低，且均低于其余3组，而胸肺总顺应性升高，且均高于其余3组。

这提示使用氦氧通气
或氦氧通气联合乌司他丁治疗较单纯空氧通气能明显降低ALI兔模型的气道峰压、改善肺顺应性，这可能与氦气降低了气体密度而使气体在气道内更容易以层流形式运动有关[6]。

本研究结果显示，其余4组MPO活性均高于N组(P<0.05)。

有研究表明，ALI
的氧化应激水平可以通过MPO的活性来评估，炎症状态下，MPO的活性明显增加[1]，这与本实验中ALI模型建立成功后MPO明显增高是相符。

此外，在治疗
4 h后，U组和H+U组的MPO活性较M组和H组明显降低(P<0.05)，这提示
在使用乌司他丁或氦氧通气联合乌司他丁治疗后MPO的活性明显降低，推测其通过降低MPO的活性以减轻肺部的氧化应激水平，从而减轻肺部炎性反应。

虽然氦氧通气能够减轻肺部炎症[10]，但氦氧通气治疗组与模型组的MPO活性无明显差异(P>0.05)，考虑氦氧通气可能是通过其他途径减轻肺部的氧化应激水平，这有
待进一步研究证实。

ALI在临床上表现为急性非心源性的肺水肿和顽固性的低氧血症。

肺组织弥散功能障碍、通气血流比异常、肺内分流等因素均可造成低氧血症。

本研究中，M组、
H组、U组及U+H组在模型建立后即刻的PaO2均明显低于N组，在治疗后4 h 均较前升高，M组、H组仍明显低于N组，但U组及U+H组接近N组水平，这提示采用乌司他丁或氦氧通气联合乌司他丁治疗的ALI兔模型低氧血症明显改善。

有研究报告了乌司他丁有抗氧化、改善组织灌注和微循环的作用，这可能与其改善ALI的低氧血症有关[8]。

而氦氧通气虽然可以减少肺组织的炎性渗出，减轻水肿，但氧合作用无明显改善，这可能与炎症反应改善有限而未能达到影响通气血流比的
程度有关。

研究表明在ALI的渗出期、增殖期、纤维化期都伴有肺组织细胞凋亡[9]。

本研究发现，U组及U+H组的肺组织凋亡率较M组、H组明显下降(P<0.05)，而H组与M组的凋亡率无明显差异(P>0.05)，这提示乌司他丁对ALI肺组织细胞凋亡有抑制作用。

综上所述，氦氧通气或者乌司他丁单独治疗盐酸诱导的ALI，均有一定的肺保护作用，而氦氧通气联合乌司他丁治疗兼顾氦气低密度高运动黏性及乌司他丁能抑制炎症介质过度释放的特点，能够降低气道压、改善胸肺总顺应性、改善氧合、降低MPO活性、减轻肺组织炎症反应、减少炎症渗出、降低凋亡率，对ALI 有保护作用。

【相关文献】
[1] Gluck EH,Onorato DJ,Castriotta R.Helium-oxygen mixtures in intubated patients with status asthmaticus and respiratory acidosis[J].Chest,1990,98(3):693-698.
[2] Jolliet P,Tassaux D,Chevrolet JC.Helium-oxygen mixtures in acute respiratory
failure[J].Intensivmedizin und Notfallmedizin,2001,38(1):83-89.
[3] Gerbeaux P,Gainnier M,Arnal JM,et al.Effects of helium-oxygen mixtures on endotracheal tubes:an in vitro study[J].J Biomech,2005,38(1):33-37.
[4] Sato Y,Ishikawa S,Otaki A,et al.Induction of acute-phase reactive substances during open-heart surgery and efficacy of ulinastatin.Inhibiting cytokines and postoperative organ injury[J].Jpn J Thorac Cardiovasc Surg,2000,48(7):428-434.
[5] Gao C,Liu Y,Ma L,et al.Protective effects of ulinastatin on pulmonary damage in rats following scald injury[J].Burns,2012,38(7):1 027-1 034.
[6] Rodrigo G,Pollack C,Rodrigo C,et al.Heliox for treatment of exacerbations of chronic obstructive pulmonary disease[J].Cochrane Database Syst Rev,2002(2):CD003571.
[7] Yilmaz S,Daglioglu K,Yildizdas D,et al.The effectiveness of heliox in acute respiratory distress syndrome[J].Ann Thorac Med,2013,8(1):46-52.
[8] Inoue K,Takano H,Yanagisawa R,et al.Antioxidative role of urinary trypsin inhibitor in acute lung injury induced by lipopolysaccharide[J].Int J Mol Med,2005,16(6):1 029-1 033.
[9] Galani V,Tatsaki E,Bai M,et al.The role of apoptosis in the pathophysiology of Acute Respiratory Distress Syndrome(ARDS):an up-to-date cell-specific review[J].Pathol Res
Pract,2010,206(3):145-150.
[10]陈冬梅,翁钦永.氦氧机械通气对急性肺损伤兔肺组织炎症反应和细胞凋亡的影响[J].中国临床医学,2013,20(6):751-754,758.。