碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌多黏菌素耐药性调查及分子机制分析

ＤＯＩ：
１０．１３６０２／ｊ．ｃｎｋｉ．ｊｃｌｓ．２０２０．０８．０９
·临床实验研究·
碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌多黏菌素耐药性调查及分子机制分析
张雪，谢小芳，王敏，郑毅，杜鸿（苏州大学附属第二医院检验科，江苏苏州２１５００４）
摘要：目的　了解在我国临床正式应用多黏菌素前碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌（
ｃａｒｂａｐｅｎｅｍ ｒｅｓｉｓｔａｎｔＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａ，ＣＲＥ）多黏菌素的耐药现状和耐药机制。

方法　收集２０１７年１月至１２月苏州、成都、北京３个地区临床分离的非重复ＣＲＥ菌株，用微量肉汤稀释法和Ｐｈｏｅｎｉｘ１００自动微生物系统进行药敏分析。

对多黏菌素耐药菌株，用ＰＣＲ扩增和Ｓａｎｇｅｒ测序检测ｍｃｒ １～
ｍｃｒ ９以及多黏菌素耐药调控基因突变，
用实时荧光定量ＰＣＲ检测多黏菌素耐药调控基因表达量变化。

结果　共收集３４１株ＣＲＥ菌株，检测出１１株（占３．２％）ＣＲＥ对多黏菌素耐药，包括８株肺炎克雷伯菌、２株大肠埃希菌和１株阴沟肠杆菌。

１株肺炎克雷伯菌检出ｍｇｒＢ插入序列，２株大肠埃希菌检出ｍｃｒ １基因，１株阴沟肠杆菌检出ｍｃｒ ９基因。

荧光定量ＰＣＲ结果显示，
在多黏菌素耐药菌株中ｐｍｒＡ、ｐｍｒＣ、ｐｍｒＫ和ｐｈｏＱ基因表达显著上调。

结论　即使没有使用多黏菌素治疗，也有部分ＣＲＥ菌
株对多黏菌素耐药，主要是染色体和质粒编码的耐药机制。

提示临床应加强细菌耐药监测和抗菌药物管理，避免多黏菌素耐药性的进一步传播。

关键词：碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌；多黏菌素；耐药机制中图分类号：Ｒ４４６．５ 文献标志码：ＡＳｕｒｖｅｙａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｐｏｌｙｍｙｘｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎｃａｒｂａｐｅｎｅｍ ｒｅｓｉｓｔａｎｔＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ
ＺＨＡＮＧＸｕｅ，ＸＩＥＸｉａｏｆａｎｇ，ＷＡＮＧＭｉｎ，
ＺＨＥＮＧＹｉ，ＤＵＨｏｎｇ
（ＣｌｉｎｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ，ｔｈｅＳｅｃｏｎｄＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＳｏｏｃｈｏｗＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｕｚｈｏｕ２１５００４，Ｊｉａｎｇｓｕ，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｐｉｄｅｍｉｃｓｔａｔｕｓａｎｄｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｐｏｌｙｍｙｘｉｎｆｏｒｃａｒｂａｐｅｎｅｍ ｒｅｓｉｓｔａｎｔＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉａｃｅａｅ（
ＣＲＥ）ｂｅｆｏｒｅｔｈｅｆｏｒｍａｌｃｌｉｎｉｃａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎＣｈｉｎａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅｎｏｎ ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅｃｌｉｎｉｃａｌｉｓｏｌａｔｅｓｏｆＣＲＥｗｅｒｅｃｏｌｌｅｃｔｅｄｉｎＳｕｚｈｏｕ，ＣｈｅｎｇｄｕａｎｄＢｅｉｊｉｎｇｒｅｇｉｏｎｓｆｒｏｍＪａｎｕａｒｙｔｏＤｅｃｅｍｂｅｒ２０１７．ＴｈｅｄｒｕｇｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｉｅｓｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄｂｙｂｒｏｔｈｍｉｃｒｏｄｉｌｕｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄａｎｄＰｈｏｅｎｉｘ１００ａｕｔｏｍａｔｅｄｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙｓｙｓｔｅｍ．Ｆｏｒｔｈｅｐｏｌｙｍｙｘｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｔｓｔｒａｉｎｓ，ｔｈｅｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｔｇｅｎｅｓｍｃｒ １ｔｏ ９ａｎｄ
ｔｈｅｍｕｔａｔｉｏｎｓｏｆｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｇｅｎｅｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＳａｎｇｅｒｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｔｈｅｖａｒｉａｔｉｏｎｏｆｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ
ｐｏｌｙｍｙｘｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｇｅｎｅｓｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｒｅａｌ ｔｉｍｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ａｔｏｔａｌｏｆ３４１ｓｔｒａｉｎｓｏｆＣＲＥ
ｗｅｒｅｃｏｌｌｅｃｔｅｄ，
ｏｆｗｈｉｃｈ１１ｓｔａｉｎｓ（３．２％
）ｗｅｒｅｒｅｓｉｓｔａｎｔｔｏｐｏｌｙｍｙｘｉｎ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ８Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，２Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉａｎｄ１
Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｃｌｏａｃａｅ．ＴｈｅｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｍｇｒＢｗａｓｄｅｔｅｃｔａｂｌｅｉｎａｓｔｒａｉｎｏｆＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，ｔｈｅｍｃｒ １ｇｅｎｅｗａｓｄｅｔｅｃｔａｂｌｅｉｎ２
ｓｔｒａｉｎｓｏｆＥ．ｃｏｌｉ，
ａｎｄｍｃｒ ９ｇｅｎｅｗａｓｄｅｔｅｃｔａｂｌｅｉｎａｓｔｒａｉｎｏｆＥ．ｃｌｏａｃａｅ．Ｒｅａｌ ｔｉｍｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆｐｍｒＡ，ｐｍｒＣ，ｐｍｒＫａｎｄｐｈｏＱｇｅｎｅｓｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｕｐ ｒｅｇｕｌａｔｅｄｉｎｐｏｌｙｍｙｘｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｔｓｔｒａｉｎｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｅｖｅｎｉｆｐｏｌｙｍｙｘｉｎｄｉｄｎｏｔａｄｏｐｔｅｄｉｎｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｓｏｍｅＣＲＥｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅｆｏｕｎｄｔｏｂｅｒｅｓｉｓｔａｎｔｔｏｐｏｌｙｍｙｘｉｎｗｈｉｃｈｍａｙｂｅｍａｉｎｌｙｄｕｅｔｏｔｈｅｒｅ
ｓｉｓｔａｎｃｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｅｎｃｏｄｅｄｂｙｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓａｎｄｐｌａｓｍｉｄｓ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇｆｏｒｂａｃｔｅｒｉａｌｒｅｓｉｓｔ ａｎｃｅａｎｄｔｈｅｍａｎａｇｅｍｅｎｔｏｆａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌｄｒｕｇｓｈｏｕｌｄｂｅｐａｉｄｓｐｅｃｉａｌａｔｔｅｎｔｉｏｎｉｎｃｌｉｎｉｃａｌｐｒａｃｔｉｃｅｔｏａｖｏｉｄｔｈｅｆｕｒｔｈｅｒｓｐｒｅａｄｏｆｐｏｌｙ ｍｙｘｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：
ｃａｒｂａｐｅｎｅｍｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｔＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ；
ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ；
ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｍｅｃｈａｎｉｓｍ
碳青霉烯类药物是治疗肠杆菌科细菌感染，特别是产超广谱β 内酰氨酶（ＥＳＢＬｓ）和／或ＡｍｐＣ酶的多重耐药肠杆菌科细菌的一线药物之一［１
］。

据中国细菌耐药监测网（ＣｈｉｎａＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌＳｕｒｖｅｉｌ
ｌａｎｃｅＮｅｔｗｏｒｋ，
ＣＨＩＮＥＴ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｉｎｅｔｓ．ｃｏｍ．）数据显示，肠杆菌科细菌对亚胺培南和美罗培南的耐
药率一直呈上升趋势，分别从２００５年的３．１％和
２．１％上升至２０１９年的１１．５％和１１．４％。

而多黏菌素用于治疗多重耐药革兰阴性杆菌感染的应用也越来越多。

然而碳青霉烯类和多黏菌素耐药性的共同出现，成为临床治疗难题，使感染控制和管理变得更加困难。

基金项目：江苏省科技厅重点研发计划（ＢＥ２０１７６５４）；苏州市临床微生物学重点实验室项目（ＳＺＳ２０１７１５）；苏州市科技计划民生科技
项目（
ＳＹＳ２０１６１９，ＳＬＴ２０１９３４）。

作者简介：张雪，１９９５年生，女，技师，硕士研究生，从事微生物临床检验工作。

通信作者：杜鸿，主任技师，教授，博士研究生导师，Ｅ ｍａｉｌ：ｈｏｎｇ＿ｄｕ＠１２６．ｃｏｍ。

目前，多黏菌素、替加环素以及头孢他啶／阿维巴坦是碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌（Ｃａｒｂａｐｅｎｅｍ
ｒｅｓｉｓｔａｎｔＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ，ＣＲＥ）造成感染的有效治疗药物。

在我国，多黏菌素于２０１７年１月被批准
作为注射药物用于治疗细菌感染，并于２０１７年底被临床采用（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｏｈｒｓｓ．ｇｏｖ．ｃｎ／ｇｋｍｌ／ｚｃｆｇ／
ｇｆｘｗｊ／２０１７０２／ｔ２０１７０２２３＿２６６７７５．ｈｔｍｌ）。

但多黏菌素作为老药新用，仍存在很多问题。

本研究收集３
个不同地区２０１７年１月至１２月临床ＣＲＥ分离株，检测多黏菌素耐药ＣＲＥ流行状况和耐药机制，为采取合理的用药方案，遏制此类菌株的持续感染和暴发流行提供参考依据。

１　材料与方法
１．１　菌株来源　收集２０１７年１月至１２月苏州、成都、北京３个地区临床连续分离的非重复ＣＲＥ共
３４１株，包括肺炎克雷伯菌２１８株、大肠埃希菌６２株、阴沟肠杆菌３１株、弗氏柠檬酸杆菌１１株、产气
克雷伯菌１０株、产酸克雷伯菌５株和黏质沙雷菌４株。

根据美国临床和实验室标准化协会（Ｃｌｉｎｉｃａｌ
ａｎｄＬａｂｏｒａｔｏｒｙＳｔａｎｄａｒｄｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＣＬＳＩ）２０１８年更新的指南，亚胺培南、美罗培南和厄他培南最低抑菌
浓度（ｍｉｎｉｍｕｍｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ＭＩＣ）＞
２μｇ／ｍＬ即为耐药［２］，至少对其中之一耐药的肠杆菌科细菌判定为ＣＲＥ。

质控菌株大肠埃希菌ＡＴＣＣ
２５９２２为本实验室保存菌种。

所有菌株经基质辅助激光解吸电离－飞行时间质谱（ＭＡＬＤＩ ＴＯＦＭＳ）仪
鉴定到种。

１．２　仪器和试剂　ＭＡＬＤＩ ＴＯＦＭＳ仪（德国Ｂｒｕｋｅｒ公司），Ｐｈｏｅｎｉｘ １００全自动细菌鉴定仪、Ｐｈｏｅｎｉｘ
Ｍ５０自动微生物系统（美国ＢＤ公司），ＰＣＲ扩增仪（美国ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ公司），凝胶成像系统分析
仪、实时荧光定量ＰＣＲ扩增仪（美国Ｂｉｏ Ｒａｄ公司），核酸检测仪（美国ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公司），３７３０ｘｌ测序仪（美国ＡＢＩ公司）；多黏菌素Ｂ（美国Ｓｉｇｍａ公司），ＤＬ２０００分子质量标准ｍａｒｋｅｒ（日本ＴａＫａＲａ公司），Ｔｒｉｚｏｌ试剂（Ａｍｂｉｏｎ公司），第一链ｃＤＮＡ合成试剂盒（美国ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公司），ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ（美国ＡｐｐｌｉｅｄＢｉ ｏｓｙｓｔｅｍｓ公司），ＰＣＲ引物由上海Ｓａｎｇｏｎ公司合成。

１．３　药敏试验　用欧洲药敏试验委员会（ＥｕｒｏｐｅａｎＣｏｍｍｉｔｅｅｏｎＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌＳｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙＴｅｓｔｉｎｇ，
ＥＵＣＡＳＴ）推荐的微量肉汤稀释法检测并判读多黏菌素Ｂ的ＭＩＣ值［３］。

对多黏菌素耐药ＣＲＥ菌株，其他常用临床抗菌药物的体外药敏试验由ＰｈｏｅｎｉｘＭ５０自动微生物系统进行评估，并按照２０１８年ＣＬＳＩ标准，用Ｋ Ｂ法复核，并用ＣＬＳＩ指南或ＥＵＣＡＳＴ指南（替加环素）进行解释［２ ３］。

１．４　多位点序列分型（ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓｓｅｑｕｅｎｃｅｔｙｐｉｎｇ，ＭＬＳＴ）　使用文献报道的引物序列、反应体系及反应参数，用ＰＣＲ法扩增多黏菌素耐药的肺炎克雷伯菌（ｒｐｏＢ、ｉｎｆＢ、ｐｈｏＥ、ｍｈｄ、ｐｇｉ、ｇａｐＡ、ｔｏｎＢ）［４］、大肠埃希菌（ａｄｋ、ｆｕｍＣ、ｇｙｒＢ、ｉｃｄ、ｍｄｈ、ｐｕｒＡ、ｒｅｃＡ）［５］和阴沟肠杆菌（ｒｐｏＢ、ｄｎａＡ、ｆｕｓＡ、ｇｙｒＢ、ｐｙｒＧ、ｒｐｌＢ、ｌｅｕＳ）［６］各自７个管家基因。

ＰＣＲ扩增产物由上海Ｓａｎｇｏｎ公司用３７３０ｘｌ测序仪进行Ｓａｎｇｅｒ法测序，用Ｃｈｒｏｍａｓ软件分析，测序结果与ｈｔｔｐ／／ｗｗｗ．ｍｌｓｔ．ｎｅｔ上公布的相应基因的等位基因序列进行比较，获得该菌株针对７个管家基因的等位基因谱，提交ＭＬＳＴ网站，确定临床分离株的序列分型（ｓｅｑｕｅｎｃｅｔｙｐｅ，ＳＴ）。

１．５　多黏菌素耐药基因ｍｃｒ １～ｍｃｒ ９检测　用
ＰＣＲ技术检测多黏菌素耐药ＣＲＥ菌株中质粒介导的多黏菌素耐药基因ｍｃｒ １～ｍｃｒ ９。

ｍｃｒ １～ｍｃｒ ８
引物序列参考Ｒｅｂｅｌｏ等［７］和Ｂｏｒｏｗｉａｋ等［８］研究。

ｍｃｒ ９引物根据ＧｅｎＢａｎｋ中发表的基因序列，用ＰｒｉｍｅｒＰｒｅｍｉｅｒ５．０软件设计，ＭＣＲ ９Ｆ：５′ ＴＴＴＧＡＴＴＧＣＡＧＧＴＧＴＴＧＣＣＧ ３′，ＭＣＲ ９Ｒ：５′ ＡＣＡＡＣＣＧＣＣＡＴ
ＣＧＴＴＣＴＣＴＴ ３′。

反应体系共２０μＬ，包括５．０μｍｏｌ／Ｌ上、下游引物各１μＬ，ＤＮＡ模板２μＬ，ＰＣＲｍｉｘｔｕｒｅ
１０μＬ，ｄｄＨ２Ｏ６μＬ。

反应参数：９５℃５ｍｉｎ；９５℃３０ｓ，５８℃３０ｓ，７２℃６０ｓ，共３５个循环；７２℃
５ｍｉｎ。

扩增阳性产物由上海Ｓａｎｇｏｎ公司用３７３０ｘｌ测序仪进行Ｓａｎｇｅｒ法测序，用Ｃｈｒｏｍａｓ软件分析，测
序结果与ＧｅｎＢａｎｋ的原序列进行比对。

１．６　多黏菌素耐药调控基因突变检测　用ＰＣＲ技术对多黏菌素耐药ＣＲＥ菌株的耐药调控基因ｐｍｒＡ、
ｐｍｒＢ、ｐｈｏＰ、ｐｈｏＱ、ｍｇｒＢ［９］进行扩增，使用文献报道的引物序列、反应体系及反应参数。

ＰＣＲ扩增产物
由上海Ｓａｎｇｏｎ公司用３７３０ｘｌ测序仪进行Ｓａｎｇｅｒ法测序，用Ｃｈｒｏｍａｓ软件分析，测序结果与ＧｅｎＢａｎｋ的原序列进行比对，分析突变位点。

１．７　实时荧光定量ＰＣＲ（ｒｅａｌ ｔｉｍｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ
ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ，ＲＴ ｑＰＣＲ）　对多黏菌素耐药ＣＲＥ菌株，以同期临床分离的多黏菌素敏感ＣＲＥ菌株为
对照，采用ＲＴ ｑＰＣＲ检测多黏菌素耐药调控基因ｐｍｒＡ、ｐｍｒＣ、ｐｍｒＫ和ｐｈｏＱ表达量的变化。

根据ＧｅｎＢａｎｋ中发表的基因序列，通过ＰｒｉｍｅｒＰｒｅｍｉｅｒ５．０设计特异性引物，引物序列见表１。

将菌株在阳离子调节Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ肉汤（ＣＡＭＨＢ）中培养至生长对数期，即０．５麦氏浊度单位，采用Ｔｒｉｚｏｌ法提取细菌总ＲＮＡ。

按照ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ
ＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓ试剂盒说明书将ＲＮＡ逆转录成ｃＤＮＡ，反应体系共２０μＬ，包括５×Ｒｅａｃｔｉｏｎ
Ｂｕｆｆｅｒ４μＬ，ＲｉｂｏＬｏｃｋＴＭＲＮＡ酶抑制剂（２０Ｕ／μＬ）１μＬ，１０ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ２μＬ，ＲｅｖｅｒｔＡｉｄＴＭＭ ＭｕＬＶ逆转录酶（２００Ｕ／μＬ）１μＬ，ＲＮＡ模板１μＬ，ＤＥＰＣ水１１μＬ。

反转录条件为：２５℃５ｍｉｎ，
４２℃６０ｍｉｎ，７０℃５ｍｉｎ。

采用相对定量的方法，以ｒｏｐＢ为内参，按照ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ操作步骤进行
ＲＴ ｑＰＣＲ。

每个样品设置３个重复孔，以ＤＥＰＣ水为空白对照模板。

反应体系共２０μＬ，包括１∶１０稀
释的ｃＤＮＡ模板１μＬ，１０μｍｏｌ／Ｌ上、下游引物各
１μＬ，２×ＳＹＢＲＧｒｅｅｎｑＰＣＲＭｉｘ１０μＬ，ｄｄＨ２Ｏ７μＬ。

反应条件：９５℃３０ｓ；９５℃５ｓ，５４℃退火／延伸，共
４０个循环；７２℃开始检测，以０．５℃为台阶温度停留５ｓ采集荧光信号，进行熔解曲线分析。

计算相
对表达量，目的基因相对表达量＝２－ΔΔＣｔ，其中Ｃｔ为阈值循环数，ΔＣｔ＝Ｃｔ目的基因－Ｃｔ内参基因，ΔΔＣｔ＝ΔＣｔ实验组－ΔＣｔ对照组。

表１　引物序列
基因名称引物序列（５′→３′）产物大小（ｂｐ）ｐｍｒＡＦ：ＧＣＡＧＧＧＧＴＴＡＡＴＴＣＴＧＧＣＧＡＴＧＣ７９
Ｒ：ＣＧＡＴＡＧＣＧＣＧＧＣＴＴＣＧＴＧＣ
ｐｍｒＣＦ：ＡＡＣＧＣＴＣＣＣＣＧＴＡＡＧＡＡＣＣＴ１１０
Ｒ：ＧＴＴＡＴＣＣＧＣＴＣＧＣＧＡＡＧＴＣＴ
ｐｍｒＫＦ：ＣＧＣＴＧＡＡＴＡＴＧＣＴＣＧＡＣＣＣＡＧＡＡＧ１２７
Ｒ：ＧＣＴＧＧＣＧＧＴＡＡＴＣＧＴＣＴＧＴＡＣＧ
ｐｈｏＱＦ：ＡＴＡＴＧＣＴＧＧＣＧＡＧＡＴＧＧＧＡＡＡＡＣＧＧ１０２
Ｒ：ＣＣＡＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＡＴＣＡＣＧＣＴ
ｒｏｐＢＦ：ＡＡＧＧＣＧＡＡＴＣＣＡＧＣＴＴＧＴＴＶＡＧＣＣ１３２
Ｒ：ＴＧＡＣＧＴＴＧＣＡＴＧＴＴＣＧＣＡＣＣＣＡＴＣＡ
１．８　统计学分析　用ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ７．０软件进行。

采用非配对ｔ检验和Ｗｅｌｃｈ′ｓｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ，以Ｐ＜
０．０５为差异有统计学意义。

２　结果
２．１　药敏试验结果　多黏菌素药敏检测结果显示，
１１株（３．２％，１１／３４１）ＣＲＥ对多黏菌素耐药。

肺炎克雷伯菌耐药率最高（３．７％，８／２１８），其次是大肠埃
希菌（３．２％，２／６２）和阴沟肠杆菌（３．１％，１／３２）。

临床常用抗菌药物药敏检测结果显示，多黏菌素耐药菌株对碳青霉烯类药物、头孢菌素、氨曲南、
β 内酰胺类／β 内酰胺酶抑制剂复合物、喹诺酮类耐药率均较高（＞７０％），对阿米卡星、庆大霉素、妥布
霉素、复方磺胺甲 唑的耐药率较低，分别为９．１％、３６．４％、２７．３％、４５．４％。

见表２。

表２　多黏菌素耐药ＣＲＥ菌株抗菌药物药敏结果［ｎ（％）］药物名称敏感中介耐药
亚胺培南０（０．０）０（０．０）１１（１００．０）美罗培南０（０．０）０（０．０）１１（１００．０）厄他培南１（９．１）０（０．０）１０（９０．９）头孢唑林０（０．０）０（０．０）１１（１００．０）头孢曲松０（０．０）０（０．０）１１（１００．０）头孢他啶０（０．０）０（０．０）１１（１００．０）头孢噻肟０（０．０）０（０．０）１１（１００．０）头孢吡肟１（９．１）２（１８．２）８（７２．７）氨曲南２（１８．２）０（０．０）９（８１．８）氨苄西林／舒巴坦０（０．０）０（０．０）１１（１００．０）阿莫西林／克拉维酸１（９．１）０（０．０）１０（９０．９）哌拉西林／他唑巴坦０（０．０）０（０．０）１１（１００．０）阿米卡星９（８１．８）１（９．１）１（９．１）庆大霉素７（６３．６）０（０．０）４（３６．４）妥布霉素８（７２．７）０（０．０）３（２７．３）环丙沙星０（０．０）０（０．０）１１（１００．０）左氧氟沙星１（９．１）１（９．１）９（８１．８）呋喃妥因１（９．１）３（２７．３）７（６３．６）复方磺胺甲 唑６（５４．５）０（０．０）５（４５．５）
２．２　ＭＬＳＴ分型　ＭＬＳＴ分型显示，１１株多黏菌素耐药ＣＲＥ菌株中，肺炎克雷伯菌中以ＳＴ４８型为主
（７５．０％，６／８），其次是ＳＴ１１型（２５．０％，２／８）。

２株大肠埃希菌分别为ＳＴ１３１型和ＳＴ１５６型，１株阴沟肠杆菌为ＳＴ７４型。

２．３　多黏菌素耐药基因ｍｃｒ １～ｍｃｒ ９检测结果　
１１株多黏菌素耐药ＣＲＥ中，检出２株大肠埃希菌携带ｍｃｒ １基因，１株阴沟肠杆菌携带ｍｃｒ ９基因，经
测序分析，与ＧｅｎＢａｎｋ的原序列（ＭＴ０７０４１０．１和
ＭＫ０７０３３９．１）一致性为１００％。

８株肺炎克雷伯菌均未检出ｍｃｒ １～ｍｃｒ ９。

部分电泳结果见图１。

２．４　多黏菌素耐药调控基因检测结果　在１株肺炎克雷伯菌中检出ｍｇｒＢ基因第４１个碱基处插入１
个反向的ＩＳＫｐｎ２６，并在两端形成４ｂｐ大小的正向重复序列，见图２。

其他基因ｐｍｒＡ、ｐｍｒＢ、ｐｍｒＣ、
ｐｈｏＰ、ｐｈｏＱ中未检出已知的多黏菌素耐药有关的基因突变。

注：Ａ，ｍｃｒ ９扩增产物部分电泳分析：１，阴性对照；２，阳性对照；３，待测菌株；Ｍ，ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ。

Ｂ，ｍｃｒ １扩增产物部分电泳分析：１，待测菌株；３，阴性对照；２，阳性对照；Ｍ，ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ。

图１　多黏菌素耐药ＣＲＥ菌株ｍｃｒ １和ｍｃｒ ９基因扩增产物电泳分析
图２　ｍｇｒＢＩＳＫｐｎ２６插入序列２．５　实时荧光定量ＰＣＲ结果　对大肠埃希菌和阴沟肠杆菌外的多黏菌素耐药肺炎克雷伯菌菌株进行
ＲＴ ｑＰＣＲ检测。

与同期临床分离的多黏菌素敏感肺炎克雷伯菌株ＰＳ１相比，８株多黏菌素耐药肺炎
克雷伯菌的ｐｍｒＡ、ｐｍｒＣ、ｐｍｒＫ、ｐｈｏＱ基因表达水平均明显上调（Ｐ＜０．０１），见图３。

注： ，Ｐ＜０．０５； ，Ｐ＜０．０１； ，Ｐ＜０．００１。

图３　实时荧光定量ＰＣＲ检测分析结果
３　讨论
多项研究报道了在ＣＲＥ中检测到多黏菌素耐药，并与其他耐药基因（ｂｌａＮＤＭ １
、ｂｌａＮＤＭ ５、ｂｌａＮＤＭ ９
、ｂｌａＫＰＣ ２
、ｂｌａＫＰＣ ３
、ｂｌａＯＸＡ ４８
、ｂｌａＯＸＡ １８１
）共存［１０
］。

本研究通过对苏州、成都、北京３个地区的３４１株ＣＲＥ菌株进行药敏试验，发现在没有使用多黏菌素的情况下，有３．２％的ＣＲＥ已经对多黏菌素耐药，且对临床
常用大多数抗菌药物高度耐药（＞７０％）
，提示在临床实践中应警惕这些已经存在的多黏菌素耐药菌株，避免其进一步传播。

目前，肠杆菌科对多黏菌素耐药主要分为染色体和质粒介导的耐药机制。

最近研究发现质粒介导的多黏菌素耐药基因ｍｃｒ已通过水平转移传播到各种生态系统，包括水、土壤、植物、动物和公共场所。

ｍｃｒ １是第一个被报道的质粒携带的多黏菌素耐药基因，通过修饰脂多糖上脂质Ａ的４′ 磷酸乙醇胺介导对黏菌素的耐药［１１
］。

本研究在２株大肠埃希菌中检测到ｍｃｒ １基因，其多黏菌素的ＭＩＣ值为
８μｇ／ｍＬ，
解释了其对多黏菌素耐药的机制。

随后发现了一系列ｍｃｒ基因，例如ｍｃｒ １．２～ｍｃｒ １．１３、ｍｃｒ ２～ｍｃｒ ２．９和ｍｃｒ ３～ｍｃｒ ９。

有研究表
明，
ｍｃｒ ９基因编码磷酸乙醇胺转移酶，与其他已知的质粒编码的ＭＣＲ（ＭＣＲ １～ＭＣＲ ８）具有３３％～６５％的同源性。

ＭＣＲ ９功能与ＭＣＲ １类似，即在脂
质Ａ中加入磷酸乙醇胺基团，
对脂多糖的结构进行修饰，在自然状态下对多黏菌素敏感性影响较小，在多黏菌素的诱导下可产生高水平的耐药［１２
］。

另一项研究表明ｍｃｒ ９在大肠埃希菌中可导致ＭＩＣ值较低的多黏菌素耐药［１３
］。

本研究中１株阴沟肠杆菌中携带ｍｃｒ ９基因，其ＭＩＣ值为４μｇ／ｍＬ，且未发现与多黏菌素耐药有关的突变，ｍｃｒ ９可能为该菌株对多黏菌素耐药的机制。

染色体介导的耐药机制由ｐｈｏＰＱ和ｐｍｒＡＢ双组分系统调控，该系统可响应低镁浓度和其他环境刺激（包括暴露于多黏菌素），使４－氨基－４－脱氧－
Ｌ－阿拉伯糖（
Ｌ Ａｒａ４Ｎ，由ｐｍｒＨＦＩＪＫＬＭ ｕｇｄ调控）和／或磷酸乙醇胺（ｐＥｔＮ，
由ｐｍｒＣ调控）对脂质Ａ进行修饰，减少细菌表面的阴离子电荷，导致多黏菌素与细菌外膜的静电结合减少。

肠杆菌科细菌主要通过破坏涉及双组分系统的基因，使细菌获得多黏菌素耐药性。

ＭｇｒＢ是一种小的跨膜蛋白质，对ＰｈｏＰＱ具有负反馈调节作用。

ｍｇｒＢ中插入序列或突变会导致ＭｇｒＢ蛋白失活，消除对ＰｈｏＰ／ＰｈｏＱ调节系统
的负反馈，并导致多黏菌素耐药［１４
］。

本研究检测到
１株肺炎克雷伯菌存在ｍｇｒＢ的插入，进一步ＲＴ ｑＰＣＲ结果显示，８株多黏菌素耐药肺炎克雷伯菌的ｐｍｒＡ、ｐｍｒＣ、ｐｍｒＫ、ｐｈｏＱ基因表达水平都明显上调（
Ｐ＜０．０１），包括７株未发现上述ｍｃｒ基因以及已知耐药调控基因突变的菌株，表明这些菌株可能
由于上调ｐｍｒＣＡＢ和ｐｍｒＨＦＩＪＫＬＭ操纵子的表达，
导致发生脂多糖修饰，从而导致多黏菌素耐药。

未使用多黏菌素的患者出现多黏菌素耐药的机制仍不清楚，在非克隆传播的情况下，可能由于质粒介导的多黏菌素耐药性水平传播。

氯己定是医院常用的消毒剂，有研究表明暴露于氯己定可导致脂多糖修饰以及相关膜蛋白表达的改变，从而导致多黏菌素耐药［１５
］。

此外，编码ＥＳＢＬｓ或碳青霉烯酶的基因转座可破坏ｍｇｒＢ基因，从而导致对多黏菌素耐药。

食用动物中的耐药菌也可通过食物链传播到人类［１６
］。

本研究由于收集的菌株数量有限，尚不能完全反映多黏菌素耐药ＣＲＥ的流行情况和耐药机制。

但从以上数据可以得出，即使在未使用多黏菌素的情况下，仍有３．２％的ＣＲＥ对多黏菌素耐药，其机制主要与染色体和质粒介导有关。

提示临床随着多黏菌素的应用，多黏菌素耐药菌株可能会被筛选并传播，因此应加强细菌耐药监测和抗菌药物管理，延缓多黏菌素耐药性的发展，为抗菌药物的疗效和安全性提供保障。

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（本文编辑：王海燕）
（上接第５９６页）
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（收稿日期：２０２０ ０５ ０６）
（本文编辑：刘群）。