蒲公英水提液中绿原酸的含量检测

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试 验 研 究
农业开发与装备 2015年第1期摘要：本试验旨在建立一种高效液相色谱-紫外检测法（HPLC-UV）测定蒲公英水提液中绿原酸含量的方法。

采用博纳艾杰尔Venusil MP C 18色谱柱 (150 mm×4.6 mm, 5 μm)，以乙腈-0.1%磷酸（15：85）为流动相，流速1.0 mL/min，检测波长327 nm，柱温25 ℃，结果表明绿原酸在2.5~40 µg/mL范围内线性关系良好（r=0.9996），平均加样回收率为96.38%(n=6)，峰面积的相对标准偏差（RSD）为2.33%。

此方法专属性强、重复性好，可用于蒲公英水提液中绿原酸的含量测定。

关键词：蒲公英；绿原酸；高效液相色谱；含量测定
蒲公英为菊科植物蒲公英Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.、碱地蒲公英Taraxacum borealisinense Kitam.或同属数种植物的干燥全草[1]。

具有清热解毒，消肿散结，利尿通淋之功效。

用于疔疮肿毒，乳痈，瘰疬，目赤，咽痛，肺痈，肠痈，湿热黄疸，热淋涩痛[2]。

本试验采用高效液相色谱法对蒲公英水提液中的绿原酸含量进行了测定，建立了一种专一性强、重复性好的测定方法,以期为蒲公英水提物的质量控制提供依据。

1 仪器与试药1.1 仪器
高效液相色谱仪（Waters Alliance e2695）；美国Millipore 水纯化系统；针筒式微孔滤膜过滤器（天津市科亿隆实验设备有限公司，孔径0.22 μm）。

1.2 药品与试剂
绿原酸（批号E-0075，购自上海同田生物技术股份有限公司）；蒲公英水提液，本实验室自制；乙腈（色谱纯，天津市光复精细化工研究所）。

2 方法与结果2.1 色谱条件
博纳艾杰尔Venusil MP C 18色谱柱（5 μm, 150 mm×4.6 mm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸(15：85)；流速1.0 ml/min；检测波长327 nm；柱温25℃。

2.2 溶液的制备
2.2.1　对照品溶液的制备。

精密称取绿原酸对照品2 mg置10ml棕色容量瓶中，用50%甲醇溶解并定容，制成浓度为0.2 mg/ml的对照
品贮存液。

精密吸取绿原酸对准品贮备液0.125、0.250、0.500、
1.000、
2.000ml，分别放置于10ml棕色容量瓶中，用50%甲醇定容至刻度，分别得到2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 µg/ml的对照品工作溶液。

2.2.2　样品溶液的制备。

称取蒲公英10 g，加入150 mL水，煮沸30 min，放冷，过滤，加水至100ml，4℃冷藏保存。

制备三批，分别为20141001、20141002、20141003。

用0.20μm滤膜过滤，取续滤液，即得蒲公英水提样品溶液。

2.3　专属性试验
精密吸取浓度为10.0µg/ml的绿原酸对照品溶液和样品溶液各10μl，注入液相色谱仪中，由色谱图知，在绿原酸对照品色谱相应的位置上，蒲公英水提液具有相同保留时间的色谱峰（见图1）。

2.4　线性关系考察
分别精密吸取浓度为2.5、5.0、10.0、20.0、40.0µg/ml的对照品工作溶液10 μl，自动进样注入高效液相色谱仪，记录峰面积，以绿原酸浓度（μg/ml）为横坐标，峰面积值为纵坐标，计算回归方程为y=38266x-10188, r=0.9996，结果表明，在2.5~40.0μg/ml范围内，峰面积与绿原酸浓度呈良好的线性关系（见图2）。

图2 绿原酸的标准曲线
2.5　精密度试验
取浓度为20.0µg/ml的绿原酸对照品溶液，连续进样6次，每次进样10μl，测定峰面积，结果峰面积的相对标准偏差（RSD）为1.21%，表明仪器精密度良好。

2.6　重复性试验取同一批蒲公英水提液，用0.20μm滤膜过滤，连续进样6次，
每次20 μl注入色谱仪，结果6份样品峰面积RSD为1.89%，说明方
法重复性良好。

2.7　溶液稳定性试验
取同一批蒲公英水提液，用0.20μm滤膜过滤，分别于0、2、
4、6、8和10 h进样10μl，测定峰面积，结果表明，绿原酸10 h内
峰面积RSD为2.78%，表明蒲公英水提液在10 h内稳定。

2.8　加样回收率试验
量取已知绿原酸含量的蒲公英水提液6份，每份8ml，置10ml棕色容量瓶中，分别加入对照品贮存液0.5ml，定容，进样10μl注入色谱仪，计算加样回收率。

结果6份样品平均回收率为96.38%，RSD 为2.33%，说明回收率良好。

（下转第162页）
蒲公英水提液中绿原酸的含量检测
王建舫，穆 祥*
（北京农学院 兽医学（中医药）北京市重点实验室，北京 102206）
图1 高效液相色谱图
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通讯作者：穆 祥。

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畜 牧 兽 医农业开发与装备 2015年第1期
传染性山羊传染性胸膜炎是由支原体引起山羊和绵羊的一种高度接触性传染病，其临诊特征是高热，咳嗽，肺实质、小叶间质及胸膜发生浆液性和纤维素性炎；肺膨大隆起，高度水肿并有明显肝变。

1 病原
山羊传染性胸膜炎病原为山羊丝状支原体。

主要存在于山羊的肺、胸水和纵隔淋巴结中，具有多形性，能通过细菌滤器，在血液琼脂培养基上培养4～5天可见大小不等的圆形菌落，对低温的抵抗力较差，对青霉素不敏感。

2 流行病学
在自然条件下，丝状支原体山羊亚种只感染山羊，尤其3岁以下的羔羊；而绵羊肺炎支原体既可感染山羊也可感染绵羊。

营养缺乏、气候骤变、羊群密集等有利于本病的发生和流行，因此多发生于冬季和早春常呈地方性流行，接触传染性很强。

病羊和带菌羊是传染源，主要经呼吸道分泌物排菌。

新疫区的暴发，几乎都由引进病羊所致。

发病后传播迅速，20天左右可波及全群。

冬季流行期平均20天，夏季可达2个月以上。

3 临床症状
根据病程和临床症状可分为最急性、急性和慢性。

3.1　最急性
病初体温升高40.5～41.7℃左右，病羊精神沉郁，食欲废绝，呼吸急促，咳嗽并流浆液性带血的鼻液，呈铁锈红色。

肺部扣诊出现浊音，听诊肺泡呼吸音呈捻发音。

随着病情发展，病重羊卧地不起，呼吸极度困难，全身颤抖，可视黏膜发绀，目光呆滞，有痛苦的呻吟声，死亡较快。

病程2～3天，有的仅1天。

3.2　急性
病初病羊咳嗽、有浆液性鼻液，体温升高，不爱运动，常卧与圈舍四周，驱赶后常出现咳嗽症状。

2～3天后咳嗽加重，鼻液变为粘液性、浆液性并呈铁锈红色或红棕色，黏附在鼻孔周围和上唇，形成污垢块。

按压胸部病羊表现敏感、疼痛，听诊肺部出现支气管呼吸音和喘鸣声。

病羊精神沉郁，翻出减少或停止。

呼吸困难，腰背弓起，头颈伸直。

眼睑肿胀粘液性的分泌物增加。

怀孕母羊大约有一半发生流产，最后病羊卧地不起，衰竭。

有的发生瘤胃鼓起，个别发生腹泻。

腹部和乳房的皮肤发生丘疹。

濒死期体温降至常温以下。

病程常为7～10天，耐过羊转为慢性病例。

3.3　慢性
病羊全身症状较轻微，有时出现咳嗽和腹泻，鼻涕时有时无，
身体衰弱，背毛促乱无光。

在此期间，如果改善管理条件，病羊可以自然康复，若饲养管理条件较差，很容易使病情加重或继发其他疾病而死亡。

4 剖检变化
主要表现于呼吸系统，其次是消化系统。

气管、支气管有大量泡沫性分泌物。

胸腔有淡黄色渗出液，肺与胸腔、胸膜广泛粘连。

肺的尖叶、膈叶部分发生实变、萎缩。

淋巴结肿大、切面多汁。

肝脏肿大，质地变硬。

肠系膜淋巴结肿大，大肠出现便秘。

5 实验室诊断
5.1　直接涂片检查
无菌操作取病死羊的心血、肝、肺及淋巴结分别用革兰氏染色法和吉姆萨染色法染色后镜检，革兰氏染色未见细菌，吉姆萨染色可见0.3～0.5μm的菌体。

5.2　细菌培养
无菌操作取病羊的肺、肝、淋巴结接种于营养琼脂和血琼脂平板37℃培养48h，未见细菌生长,而巴氏杆菌病有明显的菌落生长。

根据流行病学、临床症状、剖检变化和实验室检验，可诊断为羊传染性胸膜肺炎。

6 防治措施6.1　预防
1）严防引入病羊或带菌羊，如需引进应隔离检疫1个月以上，确认健康时方可混群。

2）该病可用羊传染性胸膜肺炎疫苗接种预防。

3）加强饲养管理，保持舍内温度适宜，通风良好，清洁卫生，供给优质饲料，增强机体抵抗力。

6.2　治疗
1）对症状较重的病羊可用肌肉注射30%盐酸林可霉素注射液10ml、10%黄芪多糖注射液10ml，连用3天即可痊愈。

对症状较重的病羊每天可采用输液治疗，30％氟苯尼考注射液10 ml、双黄连注射液10 ml、10％葡萄糖100～150 ml混合静脉注射，连用5～7天。

在肺部炎症初期，为制止渗出，促进炎性分泌物消散吸收，可肌肉注射呋噻咪4～5ml，维生素C 5ml。

2）在饲料中添加抗生素也有较好的效果，每吨饲料添加土霉素1800～2000g，连续饲喂7天。

3）对体温升高的病羊肌肉注射安乃近、鱼腥草注射液进行对症治疗，缓解症状。

对食欲不佳的病羊肌肉注射胃肠舒注射液5～8 ml或灌注反刍健胃散50～100g。

一起山羊传染性胸膜肺炎的诊治体会
范相丽
（甘肃省永靖县动物卫生监督所，甘肃永靖 731600）
2.9　样品的测定
三批蒲公英水提液，用0.20μm滤膜过滤，分别注入高效液相色谱仪，进样10μl，同时取浓度为10μg/ml的绿原酸对照品进样10μl，按照“2.1”项下条件测定，以外标一点法计算样品中绿原酸的含量，结果见表1。

表1 蒲公英中绿原酸的含量
批号绿原酸含量（mg/g）201410010.144201410020.14120141003
0.139
3　小结
本试验采用高效液相色谱-紫外检测法测定了蒲公英水提液中绿原酸的含量，方法学考察证明该试验中使用的方法良好，可以作为蒲公英水提液中绿原酸含量测定的方法。

参考文献
[1]　国家药典委员会编.中华人民共和国药典（一部）[S].北京：中
国医药科技出版社,2010:331.
[2]　刘华清,王天麟.蒲公英水溶性化学成分研究[J].中药
材,2014,37(6):989-991.
（上接第79页）
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