HCMV感染对胶质瘤细胞U87自噬的影响

HCMV感染对胶质瘤细胞U87自噬的影响
宋静宜;钱冬萌;王斌;黄睿;胡明;华晓敏;朱秀丽;陈豪;宋旭霞
【摘要】The effects of human cytomegalovirus( HCMV)infection in U87 glioma cell autophagy were studied. The expression changes of microtubule associated protein 1 light chain 3( LC3 ),autophagy related gene Beclinl and its protein were observed,and accordingly investigate the relation of genesis,development,and significance of glioma with HCMV. Glioma U87 cell was infected with HCMV strain AD169(MOI=5),and set
U87 cell without HCMV in-fection as a control group. RT-PCR was used to detect the changes of expression of Beclin1 after HCMV infection at 6 h,12 h,24 h,and 48 h respectively;Western-blot and immunofluorescence were used to test the expression of Bec-lin1 and LC3 coded proteins. Finally,CCK-8 assay was used to observe the proliferation activity of U87 glioma. The results showed that,the expression level of LC3-II protein in HCMV infected U87 cell was gradually decreased( P﹤0. 05),meanwhile,the expression level of Beclin1 gene and its protein was also gradually decreased(P﹤0. 01), moreover,the HCMV infected U87 cell proliferated significantly(P﹤0. 01). The results indicated that HCMV infec-ted and inhibited U87 glioma cell autophagy,and cause the expression level of Beclin1 to lower,and resulted in the glioma cell to proliferate.%研究人巨细胞病毒（ HCMV）感染对神经胶质瘤U87细胞自噬的影响。

通过观察微管相关蛋白1轻链3（LC3）、自噬相关基因Beclin1及其蛋白表达的变化，从而探讨HCMV与神经胶质瘤发生、发展的关系及意义。

用HCMV AD169（MOI＝5）感
染神经胶质瘤U87细胞，同时将未感染HCMV的U87细胞作为对照组。

分别在6、12、24、48 h用RT-PCR检测Beclin1的表达，Western-blot和免疫荧光检测Beclin1和LC3编码蛋白的表达，最后用CCK-8检测细胞的增殖活性。

结果显示，HCMV感染的U87细胞LC3-II蛋白表达水平逐渐下降（ P﹤0.05）；同时，HCMV感染的U87细胞Beclin1基因及蛋白的表达水平也逐渐下降（P﹤0.01），且HCMV感染U87细胞增殖显著（ P﹤0.01）。

以上结果表明，HCMV感染抑
制胶质瘤U87细胞自噬，并会引起Beclin1表达水平下调，进而导致胶质瘤细胞
增殖。

【期刊名称】《微生物学杂志》
【年(卷),期】2015(000)001
【总页数】6页(P40-45)
【关键词】人巨细胞病毒;自噬;神经胶质瘤U87细胞;细胞增殖
【作者】宋静宜;钱冬萌;王斌;黄睿;胡明;华晓敏;朱秀丽;陈豪;宋旭霞
【作者单位】青岛大学医学院病原生物学教研室，山东青岛 266071;青岛大学医学院病原生物学教研室，山东青岛 266071;青岛大学医学院病原生物学教研室，山东青岛 266071;青岛大学医学院病原生物学教研室，山东青岛 266071;青岛大学医学院病原生物学教研室，山东青岛 266071;青岛大学医学院病原生物学教研室，山东青岛 266071;青岛大学医学院病原生物学教研室，山东青岛 266071;青岛大学医学院病原生物学教研室，山东青岛 266071;青岛大学医学院病原生物学教研室，山东青岛 266071
【正文语种】中文
【中图分类】Q939.93;R373.9
人巨细胞病毒(Human Cytomegalovirus，HCMV)属疱疹病毒β亚科，为线状双链DNA病毒，人群中存在普遍潜伏感染[1] 。

近年来，一直有关于HCMV感染与胶质瘤潜在关系的研究报道。

Mitchell等[2] 研究发现在90%以上的胶质母细胞瘤组织中可检测到HCMV基因组及其蛋白；Cobbs等[3]将HCMV基因转入胶质瘤细胞内发现肿瘤细胞生长加快、侵袭性增强。

提示HCMV感染与胶质瘤发生、发展可能存在某种关系。

然而，目前HCMV与肿瘤之间作用机制还不明确。

近来有研究表明自噬活性的改变在肿瘤的发生、发展过程中起重要作用[4]。

自噬是一种
自我平衡的过程，在维持细胞结构、代谢和功能中起重要作用，当病毒感染细胞后，自噬的平衡被打破，与自噬相关的蛋白表达也随之发生变化。

Beclin1作为一个重要的抑癌基因，其基因产物是与自噬相关的蛋白，此蛋白还与微管相关蛋白1轻
链3(microtubule associated protein 1 light chain 3，LC3)共同参与自噬体的
形成。

目前,国内外研究多见于HCMV感染对人胚肺成纤维细胞(HEF)自噬的影响，HCMV感染抑制HEF自噬[6]。

但关于HCMV感染对胶质瘤细胞自噬的影响却鲜见报道，较正常二倍体HEF而言，将肿瘤细胞作为研究对象更具临床应用意义。

因此，本实验以神经胶质瘤U87细胞作为研究对象，探讨HCMV感染U87细胞后，LC3蛋白、Beclin1 mRNA和其蛋白表达的变化，及细胞增殖活性的变化，
从而阐明HCMV感染对胶质瘤细胞自噬具抑制作用，为进一步研究HCMV感染
在胶质瘤发生发展过程中对自噬的作用及其机制奠定了基础。

1.1 材料
1.1.1 细胞与病毒人胚肺成纤维细胞(HEF)、神经胶质瘤U87细胞为本实验室保存细胞，HCMV AD169毒株为法国巴斯德研究所惠赠。

1.1.2 主要试剂与仪器 MEM(Hyclone)、DMEM/F12(Hyclone)、胎牛血清(Hyclone)、Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(Roche)、
SuperSignal West Pico Trial Kit (Thermo)、兔抗Beclin1(Santa Cruz)、兔抗
LC3(Sigma)、鼠抗IE、FITC标记的羊抗兔IgG、Cy3标记的羊抗鼠IgG、总
RNA极速抽提试剂盒、激光共聚焦显微镜(Olympus)、白光凝胶成像系统(Vilber Lourmat)。

1.2 方法
1.2.1 细胞培养 U87细胞用含10%胎牛血清(FBS)的MEM培养液、HEF用含10% FBS的DMEM/F12培养液，置于CO2恒温培养箱培养。

分别取生长良好、处于
对数期的细胞进行后续实验。

1.2.2 HCMV病毒增殖与滴度测定将90 μL HCMV病毒株接种于生长良好的HEF中，置于CO2恒温培养箱培养。

待细胞病变至80%以上，-86 ℃、37 ℃反
复冻融3次，使细胞裂解释放病毒颗粒，-4 ℃、1 500 r/min离心8 min，收集
上清液作为病毒储存液，-86 ℃冰箱保存。

通过感染复数测定(multiplicity of infection, MOI)，确定所用病毒MOI=5。

1.2.3 电镜观察自噬小体取生长良好的U87细胞接种于细胞培养皿(密度约为
0.8×105个/mL)，培养24 h后换含2% FBS的MEM培养液，2 h后将
HCMV(MOI=5)接种于培养皿中，置于CO2恒温培养箱培养。

6、48 h后收集细胞。

加固定液固定后，再经漂洗、固定、块染、梯度脱水、浸透、包埋聚合后用透射电镜观察样品。

1.2.4 RT-PCR检测Beclin1 mRNA的表达 HCMV感染U87细胞6、12、24、
48 h后收集细胞，同时建立对照组(用含2% FBS的MEM培养液代替病毒液)并
在相同时间点收集细胞。

按总RNA抽提试剂盒说明书提取细胞总RNA后对各RNA进行反转录。

将β-actin作为内参，PCR扩增Beclin1基因，引物序列见表1。

反应体系为25 μL，扩增条件为95 ℃ 2 min，94 ℃ 15 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 20
s，35个循环，72 ℃ 2 min。

1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物后UVP凝胶成像系统拍照。

Quantity One软件进行灰度分析，将目的基因Beclin1条带与内参β-actin基因条带的灰度值的比值作为Beclin1相对表达量。

实验重复3次。

1.2.5 Western-blot检测Beclin1、LC3蛋白的表达在6、12、24、48 h时收集HCMV感染组及对照组细胞，用400 μL含有1 μmol/L PMSF的RIPA细胞裂解液提取细胞总蛋白。

各取15 μL样品进行SDS-PAGE电泳，湿转法将蛋白电转移至PVDF膜上，5g/100ml 脱脂奶粉室温封闭2 h，TBST洗膜10 min×3次；分
别加入按要求稀释后的β-actin、Beclin1、LC3抗体，4 ℃冰箱孵育过夜。

TBST
洗膜10 min×3次，加HRP标记的二抗，室温孵育2 h，TBST洗膜10 min×3次，Vilber Lourmat凝胶成像系统显影。

计算目的蛋白与内参β-Actin蛋白的灰
度之比，以此表示目的蛋白的相对表达量。

实验重复3次。

1.2.6 免疫荧光Beclin1、LC3蛋白的表达及分布在6、48 h时收集HCMV感染
组及对照组细胞，多聚甲醛固定细胞后经0.1% Trionx-100透化，10%山羊血清
封闭，过夜孵育Beclin1、LC3、IE抗体。

PBS洗涤后，加FITC、Cy3标记的二抗，37 ℃孵育2 h，hoechst室温染核10 min，75%甘油封片后在激光共聚焦显微镜下观察、拍照。

实验重复3次。

1.2.7 CCK-8检测细胞增殖活性取生长良好的U87细胞接种于96孔板(密度约为0.8×104个/mL)，每孔100 μL，分别建立HCMV感染组(HCMV分别感染U87
细胞6、12、24、48 h)、对照组、空白组(不加细胞，只含培养液)和阴性对照组(含细胞，不加病毒)，每组设5个复孔。

每孔加入10 μL CCK-8溶液，培养2 h，酶标仪检测各孔在450 nm处的OD值。

实验重复3次。

细胞增殖活力(%)=(OD感染组或对照组-OD空白组)/(OD阴性对照组-OD空白组)×100%
1.2.8 统计学分析采用SPSS17.0统计软件。

所得数据以±s表示。

组间均数比较
采用单因素方差分析，组间比较采用独立样本t检验。

P≤0.05为差异有统计学意义。

2.1 HCMV感染对U87细胞自噬水平的影响
2.1.1 电镜下观察自噬小体 HCMV感染U87细胞6、48 h后，在电镜下观察自噬小体的数目及形态。

结果显示，48 h时自噬小体数目明显减少；自噬小体形态如
图1，6、48 h分别观察到初始自噬小体(Initial autophagic vacuole，AVi)和晚
期自噬小体(Late/Degradative autophagic vacuole，AVd)，自噬小体均含膜结构(↑)。

2.1.2 HCMV感染对U87细胞自噬标志性蛋白LC3表达的影响①Western-bolt
检测LC3蛋白的表达:如图2所示，HCMV感染U87细胞6、12、24、48 h，
LC3-II相对表达量逐渐下降(P<0.05)；LC3-II/I相对表达量也呈下调趋势(P<0.01)。

而未感染组LC3-II、LC3-II/I相对表达量未见明显变化(P>0.05)。

感染组LC3-II
与LC3-II/I相对表达量均低于其对应时间的未感染组，且在48 h时2组的LC3-
II/I和LC3-II蛋白相对表达量差异均最明显(P<0.01)。

LC3-II、LC3-II/I相对表达
量见表2、表3。

②免疫荧光检测LC3蛋白的表达及分布：如图3所示，HCMV感染U87细胞6、
48 h均见LC3蛋白表达。

6 h时可见细胞质中存在大量LC3阳性颗粒，红色点状荧光密集；而48 h时LC3阳性颗粒仅位于个别细胞质内，即LC3表达水平明显
减少。

2.2 HCMV感染对U87细胞Beclin1表达的影响
2.2.1 HCMV感染对U87细胞Beclin1 mRNA表达的影响如图4所示，在6、12、24、48 h时，HCMV感染组与对照组均见Beclin 1mRNA的表达。

且随时
间增加，感染组Beclin1 mRNA相对表达量逐渐减少(P<0.01)；而对照组
Beclin1 mRNA相对表达量未有明显变化(P>0.05)。

Beclin1 mRNA相对表达量
见表4。

2.2.2 HCMV感染对U87细胞自噬相关蛋白Beclin1表达的影响①Western-bolt检测Beclin1蛋白的表达：如图5所示，在6、12、24、48 h时，HCMV 感染组与对照组均见自噬相关蛋白Beclin1的表达。

且随时间增加，感染组Beclin1蛋白相对表达水平逐渐减少(P<0.01)；而对照组Beclin1蛋白相对表达水平未见明显变化(P>0.05)。

Beclin1蛋白相对表达量见表5。

②免疫荧光检测Beclin1蛋白的表达：如图6所示，HCMV感染U87细胞6、48 h，在6 h时未见HCMV即刻早期蛋白IE的表达，48 h时IE蛋白表达；而Beclin1蛋白在6、48 h均见表达，且表达水平明显下调。

2.3 HCMV感染对U87细胞增殖的影响
如图7所示，与对照组相比，HCMV感染U87细胞6、12、24、48 h，随时间增加，细胞的增殖显著(P<0.01)，差异具有统计学意义。

人巨细胞病毒在人群中的感染率极高。

自Cobbs C.S.等[7] 首次检测到不同级别胶质瘤组织(II-IV级)中表达HCMV基因组及蛋白产物后，一直有关于HCMV感染与肿瘤潜在关系的研究报道。

Cinatl等[8]发现持续感染HCMV可能导致肿瘤细胞恶性程度增加；另有临床研究表明，HCMV感染的肿瘤细胞数量与肿瘤的恶性程度有关。

但目前HCMV与肿瘤调节的关联性及具体分子机制还未阐明。

有研究发现，自噬活性过高或过低皆可导致各种疾病的发生，肿瘤是最早发现的与自噬作用相关的疾病之一[9] ，当自噬调节异常时，会对肿瘤发生、发展等各阶段产生影响。

LC3是自噬泡形成的特征性标志，定位于自噬泡的双层膜上，在自噬形成过程中，胞浆型LC3(LC3-I)会酶解掉一段多肽，转变为膜型LC3(LC3-II)并插于内膜上。

因此，LC3转换程度可反映细胞发生自噬的水平，一般以LC3-II或LC3-II/I的表达量评估自噬水平的高低。

近来研究多见于HCMV感染对HEF自噬的影响，HEF是HCMV的允许细胞，当HCMV持续感染HEF，LC3-II表达水平
逐渐下调，即HCMV感染HEF自噬受到抑制[6]。

目前对HCMV感染胶质瘤细胞而引起自噬的变化鲜见报道。

本研究表明，在一定时间内，Western-blot和免疫荧光结果均显示LC3-II和LC3-II/I的表达量都降低，提示HCMV感染U87细胞后，自噬受到抑制。

此结果与HCMV感染HEF自噬的变化一致，自噬都呈下调趋势，即推测HCMV有抑制自噬的作用。

细胞自噬是一个复杂的过程，在此过程中涉及到多种调节分子，Beclin1就是其中之一。

Beclin1与酵母自噬基因Atg6同源，是第一个在哺乳动物中发现与自噬相
关的抑癌基因，其不仅参与自噬体形成，还有助于自噬体成熟。

Beclin1的表达与自噬的程度相关，有文献报道，在过度表达Beclin1的乳腺癌、结肠癌细胞中发现细胞增殖、克隆形成受到抑制[10-11]；同时，Qu等[12]发现Beclin1单等位基因缺失的小鼠表现出自噬水平下调，且上皮和血液系统恶性肿瘤发生率升高。

提示Beclin1基因缺失会导致某些肿瘤发生，而Beclin1过度表达则能诱导自噬，抑制肿瘤发生发展。

本研究发现，与对照组相比，感染组的RT-PCR、Western-blot、免疫荧光结果均显示随着HCMV感染U87细胞时间的增加，Beclin1的表达水平明显下降；且在此过程中，CCK-8结果表明经HCMV感染后细胞增殖显著。

提示HCMV感染U87细胞导致Beclin1基因及蛋白表达量下降，从而诱导胶质瘤细胞U87的增殖。

综上所述，本研究阐明HCMV感染抑制肿瘤细胞自噬，导致Beclin1基因及蛋白表达水平下调，从而可能会导致肿瘤细胞恶性增殖。

因此，预防HCMV感染或调节自噬水平可作为治疗胶质瘤的新靶点。

本研究仅对HCMV感染能抑制肿瘤细胞自噬并能增强肿瘤细胞的恶性程度做了初步研究，对Beclin1抑制肿瘤细胞增殖的具体机制及自噬调节与肿瘤相关性的具体分子机制还有待深入探讨。

* 通讯作者。

男，医学博士，教授，博士生导师。

研究方向为病毒基因工程与分子制药。

Tel：*************，E-mail：
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