线粒体DNA D-loop基因多态性与肾透明细胞癌关系的研究

线粒体DNA D-loop基因多态性与肾透明细胞癌关系的研究张胜雷;徐金升;白亚玲;张俊霞;崔立文;张慧然
【摘要】Objective To investigate the relationship between polymorphisms in mitochondrial displacement-loop (mtDNA D-loop) and renal cell carcinoma. Methods Fifty-nine patients with clear cell renal cell cancer (renal cancer group) and 68 healthy control (control group) were selected in this study. The mtDNA D-loop region was amplified and se-quenced using polymerase chain reaction (PCR). Data were compared and analysed with the Revised Cambridge Reference Sequence (rCRS) in library of mitochondria. The difference in frequency analyses of mtDNA D-loop region was compared be-tween two groups. Results A total of 143 single nucleotide polymorphisms (SNP) of mitochondria D-Loop region were de-tected in renal cancer group and control group. Compared with control group, there were significantly higher frequencies of 262T and 16293G alleles in mitochondria D-loop region, and significantly lower frequencies of 16298C and 16319A alleles, in renal cancer group (P<0.05). Conclusion The analysis of genetic polymorphisms in the D-loop can be used as predic-tors of renal cell carcinoma and contribute to the early detection in patients of renal cell carcinoma.%目的：探讨线粒体DNA D-loop（mtDNA D-loop）基因多态性与肾透明细胞癌的关系。

方法采用聚合酶链反应（PCR）对59例肾透明细胞癌患者（肾癌组）和68例健康对照（对照组）的mtDNA D-loop区进行扩增并测序。

将测序结果与线粒体文库中的Revised Cambridge Reference Sequence（rCRS)比对分析。

分析2组人群中mtDNA D-loop区多
态位点出现频率的差异。

结果在对照组和肾癌组中的mtDNA D-loop区共发现143个多态性位点。

与对照组比较，肾癌组患者的mtDNA D-loop区的262T、16293G出现的频率明显增高，16298C、16319A出现的频率下降（P＜0.05）。

结论 mtDNA D-loop区的多态性分析可作为肾透明细胞癌患者发生的预测因子，有助于早期发现肾透明细胞癌患者。

【期刊名称】《天津医药》
【年(卷),期】2014(000)003
【总页数】3页(P200-202)
【关键词】腺癌,透明细胞;癌,肾细胞;多态现象,遗传;序列分析;DNA,线粒体
【作者】张胜雷;徐金升;白亚玲;张俊霞;崔立文;张慧然
【作者单位】河北医科大学第四医院肾内科 050011;河北医科大学第四医院肾内
科 050011;河北医科大学第四医院肾内科 050011;河北医科大学第四医院肾内科050011;河北医科大学第四医院肾内科 050011;河北医科大学第四医院肾内科050011
【正文语种】中文
【中图分类】R737.11;R394.3
肾透明细胞癌占肾脏恶性肿瘤的85%～90%，占成人恶性肿瘤的3%[1]。

随着研
究的深入相继发现许多与肾透明细胞癌相关的肿瘤分子标志物，如碳酸酐酶Ⅸ[2]、EphA2[3]、HIF-1/VHL[4]、VEGF[5]等，但至今尚未发现能够有效诊断肾透明细
胞癌的生物学标志物。

线粒体DNA(mtDNA)作为核外唯一遗传物质处在活性氧和自由基包围之中，缺乏组蛋白保护和完整的修复系统，与核内基因组相比，
mtDNA更易发生突变[6-7]。

mtDNA突变和多态性热点区域主要集中在包括D-loop在内的非编码区域[8]，D-loop区的多态性与肝癌[9]、食管癌[10]、肺癌[11]等肿瘤的发生密切相关，但其与肾透明细胞癌发生间的关系尚不清楚。

本研究旨在探讨mtDNA D-loop基因多态性与肾透明细胞癌发病的关系。

1.1 一般资料选取我院2002年8月—2007年8月行肾癌根治术的肾透明细胞癌患者59例，作为肾癌组，其中男34例，女25例，平均年龄（5
2.6±
3.7）岁，
术前均未经过放疗、化疗，经2名资深病理专家确认病理类型均为肾透明细胞癌。

选取同期健康查体者68例作为对照组，其中男43例，女25例，平均年龄（56.9±5.2）岁。

2组间性别（χ2=0.416）、年龄（t=0.583）比较差异无统计
学意义（P＞0.05）。

1.2 DNA提取清晨空腹取2 mL静脉血，应用全血mtDNA萃取试剂盒迅速提取mtDNA，于-20℃冰箱保存备用。

1.3 引物合成及PCR扩增参照文献[9]设计扩增mtDNA D-loop区的引物。

上游：5′-CCCCATGCTTACAAGCAAGT-3′；下游：5′-GCTTTGAGGAGGTAAGCTAC-3′。

产物大小为982 bp，引物合成和纯化均由上海生工生物工程技术服务有限公
司完成。

PCR反应采用25 μL反应体系。

反应条件为：95℃预变性2 min，95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，38个循环，最后于72℃延伸5 min。

1.4 DNA测序及结果分析将PCR反应产物送至上海生工生物工程技术服务有限公司利用ABI PRISM 3100 DNA序列分析仪将PCR扩增产物进行测序，由于D-loop区序列较长，同一标本采用双向重复测序。

将测序结果拼接后，利用DNAman软件分析肾透明细胞癌患者和健康人的mtDNA D-loop区序列，并与
人mtDNA文库记录的剑桥序列（revised cambridge reference
sequence,rCRS)进行比对，筛选出mtDNA D-loop区的多态性位点。

1.5 统计学方法采用SPSS 17.0软件包进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，行t检验。

计数资料以例（构成比）表示，采用χ2检验，以P＜
0.05为差异有统计学意义。

2.1 mtDNA D-loop基因多态性位点的分布情况 2组中的mtDNA D-loop区共
发现143个多态性位点，其中有14个多态性位点在2组出现的频率大于5%，分别是262、263、309-310、315-316、488、489、523、525、16293、16298、16304、16319、16362、16519。

2.2 mtDNA D-loop区基因多态性与肾透明细胞癌之间的关系见表1。

与对照组
相比，肾癌组患者的mtDNA D-loop区的262T、16293G出现的频率明显增高，16298C、16319A出现的频率下降（P＜0.05或P＜0.01）。

mtDNA由16 568个碱基对组成，含有37个基因，其中13个蛋白质基因，2个rRNA基因，22个tRNA基因[12]。

人类衰老、糖尿病以及肿瘤等疾病的发生与mtDNA氧化损伤关系密切[13]。

近年来研究发现，在肝癌[9]、食管癌[10]、肺癌[11]等多种实体恶性肿瘤中存在mtDNA的高频率突变，提示mtDNA的突变与
肿瘤发生密切相关。

mtDNA突变主要集中在包括D-loop在内的非编码区域[9]。

D-loop区在mtDNA的转录和复制中起着重要的调控作用，D-loop区的突变可能会导致mtDNA复制和基因表达异常，最终导致肿瘤的发生。

基因多态性是指染色体基因组水平上单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，已成为继限制性片段长度多态性（RFLP）标志和微卫星标志后的第三代标志物，在多基因疾病的易感基因研究
领域广泛应用，mtDNA D-loop区多态性位点与多种肿瘤的致癌风险有关[14-15]。

本研究结果发现，肾透明细胞癌患者中多态性位点16293G（A突变为G）、
262T（C突变为T）的出现频率明显高于对照组，多态位点16293和262分别属于mtDNA D-loop高变区1和高变区2，此序列具有高突变频率，但其具体作用
机制尚不清楚[16]，可能是由于线粒体基因组转录发生改变，导致呼吸链电子传递异常，产生大量活性氧自由基，进而促进肿瘤的发生、发展，其中有文献报道16293位点的多态性与肝细胞癌发病风险有关[9]。

本研究同时发现mtDNA D-loop区的16298和16319位点突变在肾癌组低于对照组，提示16298和16319位点突变在抑制肿瘤发生过程可能起一定的作用，但其具体作用机制尚不清楚。

有文献报道16298位点的多态性在抑制小细胞肺癌中也起着一定的作用[11]。

262位点和16319位点的多态性在其他肿瘤发病风险研究中尚鲜见报道。

总之，mtDNA D-loop区的多态性分析可作为肾透明细胞癌患者发病风险的预测因子，有助于早期发现肾透明细胞癌患者。

根据肿瘤早发现、早诊断、早治疗的理念，应该建立mtDNA D-loop区多态位点分析平台，推广到其他肿瘤并筛选出易患肿瘤的高危人群，进行适当指导，以降低肿瘤发病风险。

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