二至丸对绝经后骨质疏松鼠的作用观察及可能机制研究

二至丸对绝经后骨质疏松鼠的作用观察及可能机制研究
作者：姜宜妮梁健闵建新曾文泓
来源：《世界中医药》2020年第21期
摘要目的：观察二至丸对绝经后骨质疏松模型鼠的治疗作用，并探讨其可能的作用机制。

方法：将100只雌性SD鼠随机分为空白组（n=20）和造模组（n=80），造模组大鼠均接受双侧卵巢切除术致骨质疏松模型，将成模大鼠随机分为模型组、低剂量组、中剂量组及高剂量组，每组20只，造模12 h低剂量组、中剂量组及高剂量组分别予3、6、12 g/kg二至丸灌胃，1次/d。

模型组与空白组均予1 mL生理盐水灌胃，连续干预8周，比较各组骨组织病理学、组织形态计量学、骨密度生物力、血脂代谢、组织Wnt/β-catenin通路标志性因子的改变。

结果：与空白组比较，模型组脂肪细胞明显增大，脂肪细胞密度、面积、FLAW、PPARγ显著增加，外周血TC、TG和LDL-C含量上调（P<0.01）。

与模型组比较，二至丸中剂量组和高剂量大鼠上述指标表达下调（P<0.05）;与空白组比较，模型组大鼠BV/TV、Tb.Th，Joint、骨密度、弹性模量、最大载荷、Wnt3a、β-catenin、LRP5表达均减少（P<0.05）;与模型组比较，二至丸中剂量组和高剂量组上述指标表达均显著增加（P<0.05）。

结论：二至丸可明显改善骨质疏松症，其作用机制可能与激活Wnt/LRP5/β-catenin通路有关。

关键词骨质疏松;二至丸;不同剂量;作用机制;Wnt/LRP5/β-catenin通路
AbstractObjective：To observe the therapeutic effects of Erzhiwan on Postmenopausal Osteoporosis Rat Model and discuss the possible mechanism.Methods：A total of 100 female SD rats were randomly divided into blank group（n=20）and ovariectomy group（n=80），the rats of ovariectomy group were given bilateral ovariectomy to induce osteoporosis and randomly divided into model group（n=20），low-dose group（n=20），middle-dose group（n=20）and high-dose group（n=20）.About 12 h after modeling，the low-dose group，middle-dose group and high-dose group were given Erzhiwan 3 g/kg，6 g/kg，12 g/kg by gastric perfusion per day.The rats of model group and blank group were given normal saline 1 mL by gavage.The rats were treated for 8 weeks.Bone histopathology，bone histomorphometry，biomechanics，blood lipid metabolism and changes of key factor of Wnt/β-cateni pathway were compared.Results：Compared with the blank
group，fat cell hypertrophy，density of lipocyte，cell area，FLAW and PPARγ markedly increased，TC、TG and LDL-C in Peripheral blood were down regulated in model group
（P<0.01）.Compared with the model group，the above mentioned indexes were markedly decreased in middle-dose group and high-dose group（P<0.05）.Compared with the blank group，BV/TV，Tb.Th，Joint，bone mineral density，elastic modulus，maximum load and expressions of Wnt3a，β-catenin and LRP5 markedly decreased in model group（P<0.05）.Compared with the model group，the above mentioned indexes were markedly decreased in middle-dose group and high-dose group（P<0.05）.Conclusion：Erzhiwan can prevent osteoporosis effectively，the mechanism may be related to the activatio n of the Wnt/β-catenin signaling pathway.
KeywordsOsteoporosis; Erzhiwan; Different doses; Mechanism; Wnt/β-catenin signaling pathway
中圖分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.21.011
中医并无“绝经后骨质疏松”的病名记载，根据该病的病因病机及相关临床症状将其归于“骨痿”“骨痹”“骨枯”等疾病的范畴[1]。

中医认为肾主骨生髓乃先天之本，《证治准绳》曰：“肾虚不能生肝，肝虚无以养筋，故机关不利”，由此可见“肝肾同源”下先后天之精血的互化及相互作用，共同介导骨骼疾病的转归[2]。

二至丸是补益肝肾之良方，现代中医将其大量运用于治疗绝经后骨质疏松[3-5]，但其作用机制目前尚不明了，基于此我们利用大鼠模型，不同剂量二至丸进行干预，旨在探讨二至丸治疗绝经后骨质疏松的可能机制，为临床提供客观依据，具体报道如下。

1材料与方法
1.1材料
1.1.1动物雌性SD鼠[购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司（许可证号码：SYXK（湘）2016-0002）]100只，体质量（230±15）g，鼠龄（5±0.5）个月。

所有大鼠均饲养于江西中医药大学动物实验中心SPF级动物实验室中，许可证号为：SYXK（赣）2014-0008。

大鼠接受同批次饲料喂养，饲养环境：温度（23±1）℃，湿度（50±2）%，昼夜12 h/12 h交替，干预操作均在下午14：00-17：00进行。

1.1.2药物二至丸（雷允上药业有限公司;国药准字Z32020882）。

1.1.3试剂与仪器水合氯醛溶液（广州沛瑜生物制品有限公司，货号：AAPR177-500），总胆固醇（TC）含量检测试剂盒（武汉博士康生物工程有限公司，货号：38293），三酰甘油（TG）含量检测试剂盒（武汉博士康生物工程有限公司，货号：38222），低密度脂蛋白（LDL-C）含量检测试剂盒（武汉博士康生物工程有限公司，货号：19232），高密度脂蛋白（HDL-C）含量检测试剂盒（武汉博士康生物工程有限公司，货号：18723），Wnt3a一抗抗
体（货号：23915），LRP5（货号：57315），DKK1（货号：46875），RUNX2（货号：12556s），β-catenin（货号：12475s），β-actin（货号：4970T）均购自美国CST公司。

双能X线BMD仪（奥斯托公司，韩国，型号：EXA-3000），电泳制胶架（碧云天生物公司，货号：E6030），转膜系统（Bio-Rad公司，美国，货号：E1130），台式低温高速离心机（BECKMAN公司，美国，货号：64R），酶标自动分析仪（BIO-BAD公司，美国，型号：ELX800），精密电子万能材料试验机[大迈仪器（上海）有限公司，货号：AGS-J]，微计算机断层扫描设备（micro computed tomography，Micro-CT）（BRUKER microCT公司，德国，型号：SKY SCAN-1172）
1.2方法
1.2.1分组与模型制备100只大鼠数字随机分为空白组、模型组、低剂量组、中剂量组及高剂量组，每组20只，所有大鼠在体质量、鼠龄等方面差异无统计学意义（P>0.05），可进行组间比较。

参考文献[6]中的模型制备方法：所有大鼠适应性喂养7 d，称重，用10%的水合氯醛溶液（0.2 mL/kg）腹腔内注射麻醉后固定动物于手术台上，常规无菌操作，于大鼠下腹部正中切开约1 cm的切口，逐层切开皮肤、皮下组织进入腹腔，行双侧卵巢切除术。

先结扎输卵管与伴行血管再切除卵巢，同法处理对侧。

最后，用10%青霉素溶液冲洗切口，逐层缝合。

术后3 d每只大鼠臀肌注射青霉素[2萬单位/（100 g·d）]预防感染。

空白组大鼠开腹后仅切除少量脂肪后缝合。

1.2.2给药方法造模12 h后对大鼠进行药物干预，各组干预具体如下：1）二至丸低剂量组：在无菌条件下行双侧卵巢摘除术，同时给予二至丸灌胃（3 g/kg），1次/d。

2）二至丸中剂量组：在无菌条件下行双侧卵巢摘除术，同时给予二至丸灌胃（6 g/kg），1次/d。

3）二至丸高剂量组：在无菌条件下行双侧卵巢摘除术，同时给予二至丸灌胃（12 g/kg），1次/d。

4）模型组：在无菌条件下行双侧卵巢摘除术，1 mL生理盐水灌胃对照观察。

5）空白组：大鼠开腹后仅切除少量脂肪后缝合，1 mL生理盐水灌胃对照观察。

均连续干预8周。

1.2.3检测指标与方法
1.2.3.1各组骨组织病理学改变干预结束后各组随机选取3只大鼠，充分麻醉后处死，冰上取出右侧胫骨，将组织样本置于4%多聚甲醛中固定24 h，10%EDTA脱钙42 d后，取大鼠右侧胫骨骨骺线下0.5 cm，进行密封脱水[乙醇I（100%），乙醇II（95%），乙醇III（90%），各1 h;乙醇IV（80%），乙醇V（75%），各50 min;乙醇VI（70%），45 min，二甲苯I，二甲苯II，各10 min;二甲苯III，20 min;石蜡I，50 min;石蜡II，1 h;石蜡III，90 min]、石蜡包埋、切片（厚度为5 μm），45 ℃烤片2 h，随后置于倒置显微镜下观察骨组织病理学变化（骨髓脂肪细胞平均直径、密度，脂肪空泡面积）。

1.2.3.2各组骨组织形态计量学变化利用microCT对各组大鼠右侧胫骨进行骨组织形态扫描，由此进行计量记录，从胫骨近心端骨垢线消失处开始扫描，直至胫骨远心端，扫描厚度
10 μm，共扫描70层。

应用全自动图像数字化分析仪对所得图片分析处理，记录单位体积骨小梁骨（BV/TV，1/4）、骨小梁平均宽度（Tb.Th）、骨小梁平均间距（FLAW）、骨小梁节点数（Joint）、相对类骨质量（OV/BV，1/4）、成骨细胞指数（OBI，个/mm）、矿化沉积率（MAR，m/d）、矿化延迟时间（MLT，d）、骨形成率（BFR，m/d）。

1.2.3.3各组骨密度检测干预结束后每组随机选择3只大鼠，充分麻醉后处死，取右侧股骨，使用双能X线BMD仪（DXA）检测样本的BMD，将解冻后的骨样本整齐的摆放在检测床上开始检测，结果用g/cm2表示。

1.2.3.4各组大鼠生物力学指标检测完BMD的股骨用AGS-J系列精密电子万能材料试验机检测最大载荷和弹性模量。

具体方法：将股骨头凹面朝下，股骨头端朝前的位置放置于跨距为17 mm的2个支撑点上，压头大概在股骨长度中间位置的正上方给标本施加向下10 mm/min的载荷，直至股骨断裂，最后记录并计算最大载荷和弹性模量，股骨断裂前所能承受的最大力为最大载荷，股骨断裂时所承受的力为断裂载荷。

1材料与方法
1.1材料
1.1.1动物雌性SD鼠[购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司（许可证号码：SYXK（湘）2016-0002）]100只，体质量（230±15）g，鼠龄（5±0.5）个月。

所有大鼠均饲养于江西中医药大学动物实验中心SPF级动物实验室中，许可证号为：SYXK（赣）2014-0008。

大鼠接受同批次饲料喂养，饲养环境：温度（23±1）℃，湿度（50±2）%，昼夜12 h/12 h交替，干预操作均在下午14：00-17：00进行。

1.1.2药物二至丸（雷允上药业有限公司;国药准字Z32020882）。

1.1.3试剂与仪器水合氯醛溶液（广州沛瑜生物制品有限公司，货号：AAPR177-500），总胆固醇（TC）含量检测试剂盒（武汉博士康生物工程有限公司，货号：38293），三酰甘油（TG）含量检测试剂盒（武汉博士康生物工程有限公司，货号：38222），低密度脂蛋白（LDL-C）含量检测试剂盒（武汉博士康生物工程有限公司，货号：19232），高密度脂蛋白（HDL-C）含量检测试剂盒（武汉博士康生物工程有限公司，货号：18723），Wnt3a一抗抗体（货号：23915），LRP5（货号：57315），DKK1（货号：46875），RUNX2（货号：12556s），β-catenin（货号：12475s），β-actin（货号：4970T）均购自美国CST公司。

双能X线BMD仪（奥斯托公司，韩国，型号：EXA-3000），电泳制胶架（碧云天生物公司，货号：E6030），转膜系统（Bio-Rad公司，美国，货号：E1130），台式低温高速离心机（BECKMAN公司，美国，货号：64R），酶标自动分析仪（BIO-BAD公司，美国，型号：ELX800），精密电子万能材料试验机[大迈仪器（上海）有限公司，货号：AGS-J]，微计算机
断层扫描设备（micro computed tomography，Micro-CT）（BRUKER microCT公司，德国，型号：SKY SCAN-1172）
1.2方法
1.2.1分组与模型制备100只大鼠数字随机分为空白组、模型组、低剂量组、中剂量组及高剂量组，每组20只，所有大鼠在体质量、鼠龄等方面差异无统计学意义（P>0.05），可进行组间比较。

参考文献[6]中的模型制备方法：所有大鼠适应性喂养7 d，称重，用10%的水合氯醛溶液（0.2 mL/kg）腹腔内注射麻醉后固定动物于手术台上，常规无菌操作，于大鼠下腹部正中切开约1 cm的切口，逐层切开皮肤、皮下组织进入腹腔，行双侧卵巢切除术。

先结扎输卵管与伴行血管再切除卵巢，同法处理对侧。

最后，用10%青霉素溶液冲洗切口，逐层缝合。

术后3 d每只大鼠臀肌注射青霉素[2万单位/（100 g·d）]预防感染。

空白组大鼠开腹后仅切除少量脂肪后缝合。

1.2.2给药方法造模12 h后对大鼠进行药物干预，各组干预具体如下：1）二至丸低剂量组：在无菌条件下行双侧卵巢摘除术，同时给予二至丸灌胃（3 g/kg），1次/d。

2）二至丸中剂量组：在无菌条件下行双侧卵巢摘除术，同时给予二至丸灌胃（6 g/kg），1次/d。

3）二至丸高剂量组：在无菌条件下行双侧卵巢摘除术，同时给予二至丸灌胃（12 g/kg），1次/d。

4）模型組：在无菌条件下行双侧卵巢摘除术，1 mL生理盐水灌胃对照观察。

5）空白组：大鼠开腹后仅切除少量脂肪后缝合，1 mL生理盐水灌胃对照观察。

均连续干预8周。

1.2.3检测指标与方法
1.2.3.1各组骨组织病理学改变干预结束后各组随机选取3只大鼠，充分麻醉后处死，冰上取出右侧胫骨，将组织样本置于4%多聚甲醛中固定24 h，10%EDTA脱钙42 d后，取大鼠右侧胫骨骨骺线下0.5 cm，进行密封脱水[乙醇I（100%），乙醇II（95%），乙醇III（90%），各1 h;乙醇IV（80%），乙醇V（75%），各50 min;乙醇VI（70%），45 min，二甲苯I，二甲苯II，各10 min;二甲苯III，20 min;石蜡I，50 min;石蜡II，1 h;石蜡III，90 min]、石蜡包埋、切片（厚度为5 μm），45 ℃烤片2 h，随后置于倒置显微镜下观察骨组织病理学变化（骨髓脂肪细胞平均直径、密度，脂肪空泡面积）。

1.2.3.2各组骨组织形态计量学变化利用microCT对各组大鼠右侧胫骨进行骨组织形态扫描，由此进行计量记录，从胫骨近心端骨垢线消失处开始扫描，直至胫骨远心端，扫描厚度10 μm，共扫描70层。

应用全自动图像数字化分析仪对所得图片分析处理，记录单位体积骨小梁骨（BV/TV，1/4）、骨小梁平均宽度（Tb.Th）、骨小梁平均间距（FLAW）、骨小梁节点数（Joint）、相对类骨质量（OV/BV，1/4）、成骨细胞指数（OBI，个/mm）、矿化沉积率（MAR，m/d）、矿化延迟时间（MLT，d）、骨形成率（BFR，m/d）。

1.2.3.3各组骨密度检测干预结束后每组随机选择3只大鼠，充分麻醉后处死，取右侧股骨，使用双能X线BMD仪（DXA）检测样本的BMD，将解冻后的骨样本整齐的摆放在检测床上开始检测，结果用g/cm2表示。

1.2.3.4各组大鼠生物力学指标检测完BMD的股骨用AGS-J系列精密电子万能材料试验机检测最大载荷和弹性模量。

具体方法：将股骨头凹面朝下，股骨头端朝前的位置放置于跨距为17 mm的2个支撑点上，压头大概在股骨长度中间位置的正上方给标本施加向下10 mm/min的载荷，直至股骨断裂，最后记录并计算最大载荷和弹性模量，股骨断裂前所能承受的最大力为最大载荷，股骨断裂时所承受的力为断裂载荷。

1材料与方法
1.1材料
1.1.1動物雌性SD鼠[购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司（许可证号码：SYXK（湘）2016-0002）]100只，体质量（230±15）g，鼠龄（5±0.5）个月。

所有大鼠均饲养于江西中医药大学动物实验中心SPF级动物实验室中，许可证号为：SYXK（赣）2014-0008。

大鼠接受同批次饲料喂养，饲养环境：温度（23±1）℃，湿度（50±2）%，昼夜12 h/12 h交替，干预操作均在下午14：00-17：00进行。

1.1.2药物二至丸（雷允上药业有限公司;国药准字Z32020882）。

1.1.3试剂与仪器水合氯醛溶液（广州沛瑜生物制品有限公司，货号：AAPR177-500），总胆固醇（TC）含量检测试剂盒（武汉博士康生物工程有限公司，货号：38293），三酰甘油（TG）含量检测试剂盒（武汉博士康生物工程有限公司，货号：38222），低密度脂蛋白（LDL-C）含量检测试剂盒（武汉博士康生物工程有限公司，货号：19232），高密度脂蛋白（HDL-C）含量检测试剂盒（武汉博士康生物工程有限公司，货号：18723），Wnt3a一抗抗体（货号：23915），LRP5（货号：57315），DKK1（货号：46875），RUNX2（货号：12556s），β-catenin（货号：12475s），β-actin（货号：4970T）均购自美国CST公司。

双能X线BMD仪（奥斯托公司，韩国，型号：EXA-3000），电泳制胶架（碧云天生物公司，货号：E6030），转膜系统（Bio-Rad公司，美国，货号：E1130），台式低温高速离心机（BECKMAN公司，美国，货号：64R），酶标自动分析仪（BIO-BAD公司，美国，型号：ELX800），精密电子万能材料试验机[大迈仪器（上海）有限公司，货号：AGS-J]，微计算机断层扫描设备（micro computed tomography，Micro-CT）（BRUKER microCT公司，德国，型号：SKY SCAN-1172）
1.2方法
1.2.1分组与模型制备100只大鼠数字随机分为空白组、模型组、低剂量组、中剂量组及高剂量组，每组20只，所有大鼠在体质量、鼠龄等方面差异无统计学意义（P>0.05），可进行组间比较。

参考文献[6]中的模型制备方法：所有大鼠适应性喂养7 d，称重，用10%的水合氯醛溶液（0.2 mL/kg）腹腔内注射麻醉后固定动物于手术台上，常规无菌操作，于大鼠下腹部正中切开约1 cm的切口，逐层切开皮肤、皮下组织进入腹腔，行双侧卵巢切除术。

先结扎输卵管与伴行血管再切除卵巢，同法处理对侧。

最后，用10%青霉素溶液冲洗切口，逐层缝合。

术后3 d每只大鼠臀肌注射青霉素[2万单位/（100 g·d）]预防感染。

空白组大鼠开腹后仅切除少量脂肪后缝合。

1.2.2给药方法造模12 h后对大鼠进行药物干预，各组干预具体如下：1）二至丸低剂量组：在无菌条件下行双侧卵巢摘除术，同时给予二至丸灌胃（3 g/kg），1次/d。

2）二至丸中剂量组：在无菌条件下行双侧卵巢摘除术，同时给予二至丸灌胃（6 g/kg），1次/d。

3）二至丸高剂量组：在无菌条件下行双侧卵巢摘除术，同时给予二至丸灌胃（12 g/kg），1次/d。

4）模型组：在无菌条件下行双侧卵巢摘除术，1 mL生理盐水灌胃对照观察。

5）空白组：大鼠开腹后仅切除少量脂肪后缝合，1 mL生理盐水灌胃对照观察。

均连续干预8周。

1.2.3检测指标与方法
1.2.3.1各组骨组织病理学改变干预结束后各组随机选取3只大鼠，充分麻醉后处死，冰上取出右侧胫骨，将组织样本置于4%多聚甲醛中固定24 h，10%EDTA脱钙42 d后，取大鼠右侧胫骨骨骺线下0.5 cm，进行密封脱水[乙醇I（100%），乙醇II（95%），乙醇III（90%），各1 h;乙醇IV（80%），乙醇V（75%），各50 min;乙醇VI（70%），45 min，二甲苯I，二甲苯II，各10 min;二甲苯III，20 min;石蜡I，50 min;石蜡II，1 h;石蜡III，90 min]、石蜡包埋、切片（厚度为5 μm），45 ℃烤片2 h，随后置于倒置显微镜下观察骨组织病理学变化（骨髓脂肪细胞平均直径、密度，脂肪空泡面积）。

1.2.3.2各组骨组织形态计量学变化利用microCT对各组大鼠右侧胫骨进行骨组织形态扫描，由此进行计量记录，从胫骨近心端骨垢线消失处开始扫描，直至胫骨远心端，扫描厚度10 μm，共扫描70层。

应用全自动图像数字化分析仪对所得图片分析处理，记录单位体积骨小梁骨（BV/TV，1/4）、骨小梁平均宽度（Tb.Th）、骨小梁平均间距（FLAW）、骨小梁节点数（Joint）、相对类骨质量（OV/BV，1/4）、成骨细胞指数（OBI，个/mm）、矿化沉积率（MAR，m/d）、矿化延迟时间（MLT，d）、骨形成率（BFR，m/d）。

1.2.3.3各组骨密度检测干预结束后每组随机选择3只大鼠，充分麻醉后处死，取右侧股骨，使用双能X线BMD仪（DXA）检测样本的BMD，将解冻后的骨样本整齐的摆放在检测床上开始检测，结果用g/cm2表示。

1.2.3.4各组大鼠生物力学指标检测完BMD的股骨用AGS-J系列精密电子万能材料试验机检测最大载荷和弹性模量。

具体方法：将股骨头凹面朝下，股骨头端朝前的位置放置于跨距为
17 mm的2个支撑点上，压头大概在股骨长度中间位置的正上方给标本施加向下10 mm/min的载荷，直至股骨断裂，最后记录并计算最大载荷和弹性模量，股骨断裂前所能承受的最大力为最大载荷，股骨断裂时所承受的力为断裂载荷。