动物布鲁氏菌感染重组酶聚合酶扩增检测方法的建立

动物布鲁氏菌感染重组酶聚合酶扩增检测方法的建立
布鲁氏菌病是一个世界性分布的人畜共患病,能够引起多种动物流产和胎儿死亡,对畜牧业造成很大的经济损失。

但目前尚缺少一种快速、灵敏的检测方法用于布鲁氏菌病诊断。

本试验以布鲁氏菌的bp26基因为靶基因,建立了实时重组酶聚合酶扩增(RPA)方法,并检测了不同家畜样品中的布鲁氏菌。

本试验建立的RPA方法在40 ~oC条件下反应20 min,可检测到4个拷贝的含有目的片段的重组质粒。

该RPA检测方法的灵敏性为94.9%,特异性为97.0%,分别略低于荧光定量PCR的91.5%和98.5%,但高于普通PCR的93.2%和97.0%。

将临床样品分别用虎红平板凝胶试验与RPA方法检测,阳性检出率分别为55.6%和62.2%。

该RPA方法与流产衣原体、刚地弓形虫和鼠伤寒沙门氏菌无交叉反应,说明特异性良好。

本试验建立的RPA检测方法为下一步研制动物布鲁氏菌的临床检测试剂盒奠定基础。

进一步,本试验将快速侧流式试纸与SYBR green I重组酶聚合酶扩增技术相结合,建立了检测布鲁氏菌的方法。

针对布鲁氏菌bp26基因上的IS711区域设计引物和探针,优化反应条件。

RPA在30-35℃的温度下反应10-30 min即可产生结果,其灵敏度可检测带有细菌的质粒的6个菌落形成单位和6个质粒拷贝。

该方法与流产衣原体、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌和弓形虫无交叉反应,特异性较好。

应用RPA、PCR和qPCR方法检测田间样品,结果显示,不同方法检测的结果无显著性差异,阳性检出率分别为84.4%、86.6%和84.4%。

表明将侧流式试纸与SYBR green I RPA技术结合可以作为诊断布鲁氏菌的方法,用于临床和实验室检测。

本试验研究了特异性检测马耳他型布鲁氏菌(B.melitensis)和流产布鲁氏菌(B.abortus)的双重重组酶聚合酶扩增方法。

通过比对B.melitensis和
B.abortus基因组中的特异性片段,以B.melitensis假设蛋白和B.abortus膜转运蛋白为目的基因设计引物。

反应条件经优化后确定为38℃反应20 min。

利用双重RPA方法检测
B.melitensis的灵敏度为9×10~2质粒拷贝,检测B.abortus的灵敏度为9×10~1质粒拷贝。

该双重RPA方法与检测B.melitensis bv.3,B.melitensis M5,B.abortus S19和B.suis S2等菌株以及流产衣原体、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌和弓形虫其它种病原无交叉反应,说明特异性较好。

将青海、内蒙古和新疆收集的62份田间样本,分别利用双重RPA和多重AMOS PCR进行检测。

结果显示,双重RPA检测绵羊和牦牛中的B.melitensis的阳性率为77.4%,而流产布鲁氏菌的阳性率为4.8%;多重AMOS PCR结果显示,B.melitensis的阳性率为19.3%,流产布鲁氏菌的阳性率为4.8%。

表明本试验建立的双重RPA方法可用于动物布鲁氏菌的流行病学监测。