液相芯片技术用于医院获得性呼吸道感染病原谱筛查

液相芯片技术用于医院获得性呼吸道感染病原谱筛查
王鑫磊;姚静怡;马建新;汤一苇;刘莉;卢洪洲;吴文娟
【摘要】目的建立用液相芯片技术检测医院获得性呼吸道感染病原谱的方法.方法收集301例呼吸道感染患者的鼻咽拭予样本,利用ARM-PCR技术和Luminex xMAP技术检测鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌、屎肠球菌、大肠埃希菌、阴沟肠杆菌、奇异变形杆菌、白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念殊菌、近平滑念珠菌和热带念珠菌共14种医院获得性感染病原体和甲氧西林抗性.结果 301例患者鼻咽拭子样本中检测出鲍曼不动杆菌137例(45.5%),铜绿假单胞菌88例(29.2%),肺炎克雷伯菌46例(15.3%),粪肠球菌24例(8%),阴沟肠杆菌21例(7%),金黄色葡萄球菌14例(4.7%),克柔念珠菌11例(3.7%),屎肠球菌8例(2.7%),奇异变形杆菌7例(2.3%),大肠埃希菌4例(1.3%),近平滑念珠菌1例(0.3%),甲氧西林抗性69例(22.9%).结论液相芯片技术可用于医院获得性
呼吸道感染病原谱的快速筛查.
【期刊名称】《临床检验杂志》
【年(卷),期】2010(028)004
【总页数】2页(P257-258)
【关键词】液相芯片;呼吸道;病原谱
【作者】王鑫磊;姚静怡;马建新;汤一苇;刘莉;卢洪洲;吴文娟
【作者单位】上海市公共卫生临床中心,复旦大学附属公共卫生临床中心,上
海,201508;上海市公共卫生临床中心,复旦大学附属公共卫生临床中心,上
海,201508;上海市公共卫生临床中心,复旦大学附属公共卫生临床中心,上
海,201508;上海市公共卫生临床中心,复旦大学附属公共卫生临床中心,上
海,201508;上海市公共卫生临床中心,复旦大学附属公共卫生临床中心,上
海,201508;上海市公共卫生临床中心,复旦大学附属公共卫生临床中心,上
海,201508;上海市公共卫生临床中心,复旦大学附属公共卫生临床中心,上
海,201508
【正文语种】中文
【中图分类】R446
近年来，医院获得性呼吸道感染日趋增多。

本研究利用ARM-PCR技术一次性检测多种病原体和耐药性，并用Luminex xMAP技术对PCR产物进行定性和半定量检测，分析医院获得性呼吸道病原谱。

1 材料与方法
1.1 标本来源收集2007年7月至2009年10月上海市中山医院、上海市华东医院、上海市公共卫生临床中心住院病人鼻咽拭子标本301份，其中包括中山医院132份慢性阻塞性肺病患者、华东医院26份老年呼吸道感染患者、公共卫生临床中心93份艾滋病患者和50份重症甲型流感患者的临床样本。

清晨采集鼻咽拭子后将其浸入2 ml无菌采集液(每升溶液含牛肉浸粉25 g，小牛清蛋白Ⅴ 5 g，庆大霉素0.1 g，两性霉素B 2 mg)，轻轻搅动后取出拭子，-80 ℃保存。

1.2 总核酸提取37 ℃水浴解冻样本，用全自动核酸提取仪NucliSENS® easyMAGTM(生物梅里埃公司)提取采集液中的总核酸，再加入0.5 μl RNA酶抑制剂，-80 ℃保存。

1.3 基因扩增使用医院获得性感染(hospital-acquired infection，HAI)病原体筛查试剂盒(深圳捷纳公司)进行ARM-PCR扩增，包含鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球
菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌、屎肠球菌、大肠埃希菌、阴沟肠杆菌、奇异变形杆菌、白念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌共14 种医院获得性感染病原体和甲氧西林抗性的引物。

第1轮反应条件为：95℃预变性15 min；94 ℃15 s，60 ℃ 1 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，10个循环；94 ℃ 15 s，70 ℃ 15 s，10个循环；72 ℃延伸2 min；10 ℃保存。

以生成产物为模板进行第2轮PCR，反应条件为：95 ℃预变性15 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，40个循环；94 ℃延伸3 min；10 ℃保存。

在整个扩增过程中以人核糖核酸酶P作为内参。

1.4 Luminex检测按HAI病原体筛查试剂盒的操作说明，将扩增产物与偶联了硅胶微球的探针杂交10 min，随后加入链霉亲合素-藻红蛋白标记5 min，加入反应终止液，最后使用Luminex 100进行定性和半定量检测。

每批次检测均设置空白对照及鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、甲氧西林抗性3个阳性对照。

1.5 数据分析 Luminex检测的直观结果是荧光强度数值，按试剂盒要求，本研究中cut off值为阴性对照荧光强度数值的算术平均数与5倍阴性对照数值的标准差之和，即cut off=样本的荧光强度数值≥cut off值判断阳性，相反则判阴性。

2 结果
2.1 不同人群病原学筛查结果 301例患者鼻咽拭子样本中检测出鲍曼不动杆菌137例(45.5%)，铜绿假单胞菌88例(29.2%)，肺炎克雷伯菌46例(15.3%)，粪肠球菌24例(8.0%)，阴沟肠杆菌21例(7.0%)，金黄色葡萄球菌14例(4.7%)，克柔念珠菌11例(
3.7%)，屎肠球菌8例(2.7%)，奇异变形杆菌7例(2.3%)，大肠埃希菌4例(1.3%)，近平滑念珠菌1例(0.3%)。

在检出病原体阳性的患者中，复合感染的患者有78例，占一半以上(表1)。

301例患者中检出甲氧西林抗性69例，占22.9%。

其中COPD患者26例，老年呼吸道感染患者、艾滋病患者各6例，重症甲型流感患者31例。

表1 医院获得性呼吸道感染病原学COPD老年呼吸道感染艾滋病重症甲型流感合
计单一感染48153066复合感染25305078
3 讨论
本研究通过ARM-PCR技术和液相芯片技术的联合运用，达到了在短时间内同时
检测多种医院获得性呼吸道感染病原体及部分耐药菌的目的。

相比临床上传统的细菌培养和药敏鉴定方法具有操作简单、耗时短、高敏感性和高特异性的优点；较传统的PCR单一扩增，拥有多元化、高通量的特征。

ARM-PCR(amplicon rescue multiplex-PCR)技术是近年发展起来的一项新技术，能在一次反应中对多种靶序列进行高敏感和特异性扩增和检测，其扩增过程分为富集、引入标签和扩增3个阶段。

首先低浓度的特异性引物被给予足够时间发现并
结合模板，之后引入标签，将PCR产物标记上与超级引物相同的标签序列；最后
用核酸外切酶去除第1轮PCR产物上特异引物，再用超级引物行指数扩增[1]。

通过对301例住院患者检测医院获得性呼吸道感染病原谱及甲氧西林敏感性，发
现有78例出现多种病原菌并存，形成复合感染，有69例存在甲氧西林抗性。

在
本研究中鲍曼不动杆菌达33.1%，已成为最主要的院内获得性呼吸道感染的病原体。

这可能与不动杆菌具有高度耐药性有关，应引起临床足够的重视。

同时发现以往常见的金黄色葡萄球菌的比例并不高(4.7%)，这可能是近年来依据药敏选择抗生素、尽量减少广谱抗生素应用而用窄谱抗生素如万古霉素、去甲万古霉素等，使金黄色葡萄球菌感染得到控制。

而从不同人群的病原学筛查结果看，93份艾滋病患
者样本中仅检出3例病原菌且为单一感染，明显低于其他人群，这可能与艾滋病
人在CD4低水平的情况下预防性使用抗菌药物有关[2]。

本研究材料仅是病人的鼻咽拭子采集液，在下呼吸道病原谱的筛查中尚存有一定不足。

今后可考虑补充对支气管肺泡灌洗液、痰液的检测，可望将此方法发展成直接用于临床呼吸道标本的检测，为临床的早期诊断、治疗提供依据。

4 参考文献
[1]Wang C, Sanders CM, Yang Q, et al. High throughput sequencing reveals a complex pattern of dynamic interrelationships among human T cell subsets[J]. PNAS, 2010,107(4):1518-1523.
[2]王爱霞,王福生,王清玥,等. 艾滋病诊疗指南[M]. 北京：中国知识出版社, 2005:17-21.。