WB免染流程及常见问题分析

原因：高背景和暗边缘由清洗不充分引起。 解决方法：增加清洗次数或延长清洗时间。
二抗稀释度的优化 HRP标记的山羊抗兔二抗稀释度从左到右分别为1:5,000、1:20,000、1:100,00
原因：转膜电压过高引起； 解决方法：采用无水甲醇配置转膜液或降低的转膜 时电流；
原因：多种现象的综合出现； 解决方法：比较复杂的处理方式—首先洗净膜；
“纹理”现象 蛋白带过宽
出现的问题
原因及解决的方法
条带跑得比正常的窄
1、胶凝的不均匀，聚合的不是很好，灌胶的时候尽量混匀； 有窄有宽时可能与拔梳子有关及冲洗加样孔的时候要小心， 以免把上样带扭曲； 2、胶配好了充分混匀后再灌胶； 3、样品中如果盐浓度较高，便会挤压其它条带，致使条带宽 窄不一，样品在凝胶中的运动速度会很慢，延长电泳时间； 4、系统的pH出了问题，电极缓冲液或者是凝胶缓冲液，需 要更新缓冲液；
更换电泳液之前的电泳结果
更换电泳液之后的电泳结果
Western-blot 出现问题
原因：一抗特异性差 解决方法：换一抗
原因：未过滤的封闭液导致背景有污点。
解决方法：使用0.2 μM针头式过滤器来过滤封闭液，或增加清 洗次数， 可改善此现象。
指纹
划痕和镊子痕迹
膜被折叠
原因：胶片上的反相是由过量的HRP结合二抗引起。 解决方法：将二抗稀释度提高10倍可改善检测。 左图是与1:5,000稀释的二抗孵育，右图是与1:50,000稀释的二抗孵育
你能看见转膜后还有多 少蛋白留在凝胶上
转膜后免染胶成像
No more guess about the transfer efficiency. Now you have the control – you can calculate how many percent of the total protein are still left in the post-transfer gel…
免染胶工作流程
WB实验免染胶工作流程是爱普拜公司完成的一 个WB实验的解决方案，与传统的WB实验相比其中 包括新的技术和产品：Self stain Gel（SSG）免染胶 和 Azure 成像仪，提供一个最佳的实验方案，增加 实验者的信心。
WB免染胶工作流程的特点
1. 可见电泳 2. 监控转印 3. 定量校验
显色
~5h
成像和数据分析
Azurec600<30min
>30min Often need reprobing ~5h No need to reprobe
Protein visualization on blot Multiplex WB
可见电泳-SSG免染胶技术
Azure c600 system
传统的上样量控制的方法
多色荧光对上样量的控制
In-Gel荧光实验
In-Gel荧光实验
近红外荧光成像
• PVDF／NC膜（即使是LF膜）都在可见区有自发荧光现象，而近红 外区是几乎没有自发荧光的
双近红外荧光成像的特点
优点： • 多靶点同时检测，可检测680nm和800nm 双波长（最常用染料DyLight680和 DyLight800）,可同时检测2个靶蛋白 • 定量准确，线性范围宽（5个数量级） • 可做incell和ingel实验 • 与可见RGB荧光相比，背景大大降低，灵 敏度提高。
你能看见蛋白在印迹膜上的成像
蛋白在印迹膜上的成像
Worry about protein loss during striping for reprobing?
No more worries, now you have the control – simply put the blot in the ChemiDoc MP to take a quick look…
荧光检测
化学发光 •动态信号－信号随时间变化 •信号不与目标蛋白浓度成比例关系
荧光 •静态信号－信号不随时间变化 •信号和目标蛋白浓度成比例关系
Saturation
INTENSITY
Background 0,0 0,0
TIME
High concentration / signal Medium concentration / signal
TIME
Low concentration / signal
荧光检测的特点
优点： •多靶点同时检测，比如RGB对应Cy2,Cy3,Cy5,可同 时检测3个靶蛋白 •定量准确，线性范围宽（5个数量级） •可做incell和ingel实验 缺点： 背景强，弱信号会淹没在背景中
重叠蛋白的检测
利用多重荧光检测同一个点上的重叠蛋白，免去了洗脱抗体以及孵育过程
确认转印
如何确认转膜效率？ 1. 传统WB的方法 • 考马斯亮蓝染色转膜后的胶，费时费力 • 通过预染Marker,看不见样品条带 • 丽春红染色，需额外操作，不稳定
2 .SSG免染胶 的方法
• 真正的蛋白样品可视化进行确认
你能在转膜前看our loading consistency Double check the sample quality
免染胶WB工作流程
SSG stain free gel
>1h
~1h
电泳
15-20 min
Stain Free Imaging
1-3 h
转印
Azure c600 1h More reliable loading control Sample quality control ~5h Transfer optimization
传统WB实验的工作流程
传统WB实验流程
样品准备
>1h
By eye
By Azure c600
(optional view under UV)
~1h
电泳
1-3 h
转印
检测
~5h
成像和数据分析
>30min
Often need reprobing ~5h
免染胶WB实验与传统的WB比较
传统WB实验流程
样品的准备
WesternBlot常用检测方法
Azure 多功能成像仪功能介绍
X光胶片——传统的压片
需要暗室，操作麻烦（曝光、显影、定影），只能预估时间
胶片： 动态范围只有1-1.5 底片无法警示过饱和区域-数据失真，定量不准确。 需底片及冲洗设备及暗室 暗室操作麻烦，曝光时间难 以控制，无法准确定量
Q：Western-blot 每次只加一种一抗，同时加两种或者多种一 抗，可以吗？ A：最好还是不要同时加两种一抗。因为如果结果里面有非特 异信号的话，就说不清楚了。做WB时在同一张膜上检测 目的蛋白和内参对照，可以先做目的蛋白的一抗、二抗， ECL显色、压片、洗片；漂洗以后，再做内参的一抗、二 抗，ECL显色、压片、洗片。 曾经做过Western在同一张膜上检测两种蛋白。因为这两种 目的蛋白的分子量相差较远，在一抗孵育之前，根据 Marker的条带把膜平剪开，分子量小的目的蛋白在下半张 ，大的在上半张，然后分别一抗、二抗进行检测。
CCD成像 vs 胶片
16 位深提供精确定量 宽动态范围4.8OD(在同一 个图像中可以看到最弱带 和最强带)
Azure imager system
Azure 成像仪的应用
•l
化学发光
优点：灵敏度高，无背景 缺点： • 每次只能检测一个目的蛋白 • 临近蛋白只能做重复胶或洗 脱 • 定量不准确（底物酶反应）
荧光WesternBlot发表文章的趋势
多通道荧光WesternBlot发表文章趋势
近红外InCell WB
免染胶和Azure成像仪完美结合
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 可见电泳 确认转印 总蛋白定量 化学发光检测 多通道荧光检测 近红外荧光检测 incell和incell
Q：没有注明可以用来做Western-blot的一抗，可以用来做 Western-blot吗？ A：不一定。 因为有的抗体是识别线性表位的，有的是识别构象型表位 的，识别构象型表位的抗体不能用Western-blot，因为在 Western-blot中抗体识别的是完全变性的蛋白质抗原，而 蛋白质抗原的构象型表位变性时被破坏。
向下的“皱眉”现象
“拖尾”现象
是电泳中最常见的现象。这常常是由于样品溶解不佳引起的； 解决的办法是在加样前离心，选用合适的样品缓冲液和凝胶缓 冲液，加增溶辅助试剂；另一方法是降低凝胶浓度。
常常是由于样品中不溶颗粒引起的； 解决的办法是增加溶解度和离心除去不溶性颗粒。 与邻近蛋白泳道的蛋白带相连，这是由于加样量太多或加样孔泄 漏引起的。
样品质量的控制: 免染胶技术可视化
Fraction # 1 2 3 4 C C A A C C A A C C A A C C A A T.P.
75 kDa 50 kDa
25 kDa
A total protein gel image allows a double check of the protein profiles in each sample to avoid artifacts caused by inaccurate protein assay and/or protein degradations. 样品质量的控制告诉我们什么时候终止我们的实验。。。 不要 浪费时间和金钱在不好的样品上
对于WB实验，什么是最重要的 ?
1.蛋白样品的质量（浓度、纯度） 用紫外吸收测定是否可靠？ 2.转膜的效率 预染Marker是否最合适？ 丽春红染色液操作是否简单？ 3.定量的准确性 内参是否完全可靠？ 检测方法？哪一种最合适？
问题
• 我能看见我期望的条带吗? • 如果不能看到, 哪错了? • 转印？(核实和监控转膜效率) • 样品？(确认浓度和质量) • 检测灵敏度？(更敏感的) • 如果看到了,可信吗? • 定量准确吗? (定量和上样量的控制) • 可重现吗?(监测整个转膜的过程)
Western Blot免染胶工作流程 及常见问题分析
Azure中国技术示范和服务中心
WB实验的工作流程
传统WB实验流程
样品准备
>1h
~1h
电泳
1-3 h
转印
检测
~5h
成像和数据分析
>30min Often need reprobing ~5h
问题
• 我能看见我期望的条带吗? • 如果不能看到, 哪错了? • 转印？ • 样品？ • 检测灵敏度？ • 如果看到了,可信吗? • 定量准确吗? • 可重现吗? • 我怎么才能解决这些问题呢?
蛋白带模糊不清及分辨不 佳
1、为了提高分辨率，不要加过多的样品，小体积样品可给出 窄带。 2、加样后应立即电泳，以防止扩散； 3、选择合适的凝胶浓度，使组分得以充分分离； 4、样品的蛋白水解作用也引起扩散而使分辨率降低。水解作 用通常发生在样品准备的时候，系统中的内源性蛋白酶会水 解样品蛋白，如果在缓冲液中加蛋白酶抑制剂可以减少这种 情况的发生； 5、系统的pH出了问题，电极缓冲液或者是凝胶缓冲液，需 要更新缓冲液；
定量校验
如何校正上样量？ 1.传统方法
内参校正
2.使用SSG免染胶
内参校正 总蛋白量校正
总蛋白定量
• 用每条泳道的总蛋白量做内参
总蛋白定量
通过软件进行分析
总结
• SSG免染胶WB流程给我们带来的好处 1.可见电泳，确认样品质量 2.确认转印，保证转印效率 3.总蛋白定量，校正样品上样量 4.全面监控WB流程，每个步骤都可控，保 证重现性
免染胶预混液
免染胶技术
• 带有自染成分的免染胶 丙烯酰胺/甲叉丙烯酰胺 预混液，样品制备及电 泳步骤与普通蛋白电泳 相同，电泳结束后，取 出凝胶，只需在紫外激 发光下活化，电泳分离 的蛋白质即产生可见荧 光，被CCD照相机捕获， 2min内完成蛋白质电泳 状况的检测。
可见电泳
免染胶技术的特点
1. 快速简便：可直接使用预先过滤的混合液，节省时间， 稳定的品质，一致的聚合结果 2. 无需染色：电泳结束后，只需要2min就能获得成像结果 3. 高效灵敏：免染胶的灵敏度考马斯亮蓝染色效果相同。 4. 环保无毒：无需使用有毒试剂，没有刺激性气味 5. 重复可染：免染色技术完成的凝胶还可以进行传统的 CBB-R250等染色操作，干胶保存。 6. 监控转印：免染色技术可以再Western blot 全过程中，始 终观察到蛋白的情况，实现对Western blot实验全过程的 监控。
真正覆盖Western Blot全流程！！
三、蛋白电泳及Western-blot 常见问题及解决方法
蛋白电泳出现问题
出现的问题 向上的“微笑”现象
原因及解决的方法 说明凝胶的不均匀冷却，中间部分冷却不好，所以导致凝胶中分 子有不同的迁移率所致。这种情况在用较厚的凝胶以及垂直电泳 中时常发生。 常常是由于垂直电泳时电泳槽的装置不合适引起的，特别是当凝 胶和玻璃板组成的“三明治”底部有气泡或靠近隔片的凝胶聚合 不完全便会产生这种现象。