细胞工程习题 第九章

第九章复习题

一、从培养基、培养方法、培养设备上比较分析植物细胞培养与微生物细胞培养的异同。

1、植物细胞与微生物细胞对比：

①细菌、真菌、植物细胞都有细胞壁。

②细菌无成形的细胞核，真菌、植物细胞有成形的细胞核。

③细菌只有核糖体一种细胞器。

④植物细胞比微生物细胞大（Ф10~200微米，30-100倍）。

⑤植物细胞很少以单一细胞形式悬浮生长，通常以一定细胞数的非均相细胞团

方式存在。

⑥植物细胞具有纤维素细胞壁和大的液泡，很容易被剪切力损伤。

⑦植物细胞生长速度慢，操作周期长（2-3周甚至2-3个月）。

⑧植物细胞培养基成分丰富而复杂，适合微生物生长，因此防止污染更困难。

⑨植物细胞培养一般需要光照。

2、培养基对比：

植物细胞培养的培养基主要由碳源、氮源、无机盐、维生素、植物生长激素、有机酸和一些复合物质组成。目前应用广泛的基础培养基有：MS、B5、N6等

无机盐：大量元素N/S/P/K/Ca/Mg等、微量元素

有机物：糖类、氨基酸、维生素等

调节物质：激素

与微生物培养基相比：需要大量无机盐，多种维生素和激素，一般采用无机氮源，一般以蔗糖为碳源。

3、培养方法对比：

植物细胞：经酶解法或愈伤组织法得单细胞再进行培养；方法有看护培养、饲养层培养、固体培养、细胞悬液培养

微生物细胞：固体斜面培养、液体培养

4、培养设备：

植物细胞：细胞培养生物反应器，一般都有三部分组成：反应罐、控制系统、检测分析系统。

微生物细胞：传统微生物发酵罐

二、请分析限制植物细胞培养大规模生产有价值次级代谢产物的影响因素。

次级代谢产物（Secondary metabolites）是通过次级代谢合成的产物，大多是分子结构比较复杂的小分子化合物，例如抗生素、激素、生物碱、毒素等。影响因素：

1、生物因素

①细胞株：稳定、高产、生长速度快的细胞株是细胞大规模培养生产代谢产物的前提。在进行植物细胞培养生产有价值的代谢产物时必须弄清楚产物的合成部位，也就是应该考虑到不同部位来源细胞的特性。

②细胞凋亡：是植物细胞培养过程中不可避免的现象，保证充足的营养供给以及避免有害代谢产物的积累，可以减少细胞凋亡。

③细胞团：细胞团的形成影响稳定的悬浮体系的维持，同时造成了培养物的显著异质性，细胞团表面与内部的细胞存在营养吸收和代谢产物分泌的差异。此外，

细胞团容易受剪切力影响而破碎，引起培养液粘度增加，致使气体交换与传递受到影响。要保持反应器良好的混合效果。适当大小的细胞团有利于代谢产物积累。

④生物合成机制：次级代谢产物的生物合成不同于蛋白质合成，涉及多基因参与（基因簇），机制非常复杂，影响因素非常多。结合目标产物进行生物合成机制研究，揭示代谢途径及诱导合成机制是细胞培养的重要生物学问题，有利于指导建立优化的培养工艺与技术。

2、化学因素：

①营养盐：一方面是保证植物细胞生物量的增长；另外一方面是要保证细胞能合成和积累次级代谢产物。

②前体（precursor ）：缺乏某一种前体时细胞就不能合成某一种代谢物。如果在培养基中加入外源前体将会有助于合成该代谢产物或使其产量增加。

③诱导子：

狭义诱导子：是指那些能够与细胞发生相互作用，通过细胞内一系列的信号转导过程，作用于与细胞次生代谢相关的基因表达，进而改变细胞次生代谢相关酶的活力，最终使细胞次生代谢水平发生改变的物质。

广义诱导子：是指所有能够提高细胞次生代谢相关酶活力，进而提高细胞次生代谢水平的外界因素。温度、光照、紫外线、红外线等都是广义诱导子。

④反馈抑制：植物次级代谢产物在培养系统的积累有时会对目标产物的合成具有反馈抑制。可以采用流加/半连续培养、两相培养等工艺技术克服。

3、物理因素：

①光照：光对细胞代谢产物的合成有很重要的影响。光照时间长短、光质、光强等都会对代谢产物合成和积聚产生作用。光对许多酶有诱导或抑制作用。

②温度：温度会影响酶的活性。细胞的生长速率与培养温度紧密相关。植物细胞培养一般在25℃左右进行。

③pH：会影响培养液的渗透压、酸碱度，酶的活性，从而影响细胞代谢。植物细胞液体培养的pH 变化范围在5－6 之间，最佳的起始pH在5.5－5.8 之间。

4、工程技术问题

①培养液的流变特性：由于植物细胞培养过程中容易结团，同时，不少细胞在培养过程中容易分泌粘多糖等物质，从而使传氧速率降低，影响细胞生长。粘度变化可以由细胞本身或其分泌物等引起。前者包括细胞浓度、年龄、大小、结团情况等。

②气体传递：与微生物不同，植物细胞培养一般需要光照，通过光合作用合成有机物，因此氧气和CO2的含量与传递对培养过程影响较大。氧的传递与通气速率、培养液混合程度、培养液流变特性、气液界面面积等因素有关；而氧的吸收与反应器类型、细胞生长速率、温度、pH、营养组成、细胞浓度等相关。

③搅拌与剪切力：为了加强气－液－固之间的传质，细胞悬浮培养时需要混合搅动。植物细胞虽然有较硬的细胞壁，但是细胞壁很脆弱，对搅拌的剪切力很敏感。由于剪切力比较大，细胞会自溶，次级代谢产物合成会降低。

④泡沫与器壁表面粘附性：与微生物细胞培养相比，植物细胞培养过程中产生的气泡更大，而且由于培养液含有蛋白质或粘多糖，粘度大，细胞很容易被包埋在泡沫里，造成非均相培养，也可从营养液中带出来，造成损失或污染。因此，必须对泡沫进行消除。消泡剂、机械去除。

5、提高次级代谢产物产量的途径：

培养设备：选择或设计合适的生物反应器。

培养工艺：诱导子添加、前体喂养、添加竞争途径代谢产物抑制剂、培养条件（培养基、环境条件）优化与控制、流加培养。

培养技术：固定化培养技术、两相培养技术、两步

法培养（第1步细胞生长；第2步产物积累）。

三、查阅文献，通过一个例子详细说明通过植物细胞或组织培养生产次级代谢产物的应用。

《毛状根生产次生代谢产物的研究进展》

《长春花毛状根培养及抗癌生物碱产生的研究》

植物作为天然药物、香料、色素、以及农药和工业原料等重要来源，是工业生产中不可或缺的资源。利用生物技术生产植物次生代谢产物主要有两种方法，即植物细胞培养和植物器官培养。由于毛状根具有激素自养、生长迅速、生长周期短等特点，同时由于它是分化程度很高的器官培养物，代谢通路能够比较完整地表达，尤其是一些特殊的次生代谢产物的高效合成较为稳定，为大量生产提供了有用的手段。

为建立长春花毛状根转化体系，从毛状根中获得生物碱，用发根农杆菌A4和R1000菌株分别感染长春花的不同外植体获得毛状根，并对毛状根的培养条件进行优化。

采用A4感染叶片，分别预、共培养2d及添加100mg/L的乙酰丁香酮可得到最佳转化效果，毛状根的诱导率达86.25%。以蔗糖为碳源及以水解乳蛋白为氮源的1/2MS培养基为毛状根的最佳生长条件。检测结果表明，毛状根中的总生物碱含量高于长春花的原植株和愈伤组织。

结论：通过毛状根的培养可获得抗癌生物碱长春碱和长春新碱等。