DNA和RNA提取原理和方法 PPT
DNA和RNA提取方法及原理
DNA和RNA提取方法及原理DNA提取方法及原理：1.酚/氯仿法：酚/氯仿法是最常用的DNA提取方法之一、其原理是通过酚类物质将细胞质膜破坏，使DNA从细胞内溶解出来，然后利用氯仿的重度稠化剂作用，将DNA上层的蛋白质、脂类等杂质与下层的DNA分离。
2.盐溶液法：盐溶液法是一种温和的DNA提取方法，适用于多种植物和动物样品。
其原理是将样品细胞裂解后，加入高浓度盐溶液中，通过离心分离出DNA上层液相。
3.硅胶柱法：硅胶柱法是一种高效纯化DNA的方法，可去除杂质并提高DNA的纯度。
该方法利用硅胶柱对DNA进行吸附，去除杂质，然后通过洗脱得到纯净的DNA。
这种方法常用于分离较小的DNA片段。
4.酶解法：酶解法是一种特异性较高的DNA提取方法，通过特定的酶切酶对细胞膜进行消化，将DNA释放出来。
常用的酶解酶有蛋白酶K和蛋白酶E等。
RNA提取方法及原理：1.酚酸法：酚酸法是最常用的RNA提取方法之一、它基于RNA和DNA的相对稳定性差异，利用酚酸破坏细胞膜、沉淀RNA，然后利用酚酸与蛋白质和DNA 形成复合物，分离RNA。
2.硅胶柱法：硅胶柱法也适用于RNA提取。
与DNA的硅胶柱法不同的是，RNA在硅胶柱上结合后会进行一系列的洗脱步骤，除去污染物。
该方法能有效去除DNA、蛋白质、盐和其他杂质。
3.离心收集法：离心收集法是一种简便、快速的RNA提取方法。
根据RNA在水相中的溶解性，通过离心将细胞裂解液中的RNA分离出来，然后加入酒精沉淀纯化。
4.硅酸盐法：硅酸盐法是一种特异性较高的RNA提取方法，通过利用试剂中的硅酸盐吸附RNA，并在洗涤步骤中去除杂质，从而得到纯净的RNA。
《RNA的提取》课件
可以采用离心、过滤、沉淀等方法去 除杂质，或者使用特定的吸附剂将杂 质吸附后一起去除。
提取效率低下的问题及解决方案
问题
在提取过程中，有时会出现提取效率低下的 问题，即提取出的RNA量较少或质量较差 。
解决方案
可以尝试优化提取条件，如改变缓冲液成分 、调整pH值、增加样本量等；同时，也可 以采用一些先进的提取方法和技术，如磁珠 法、亲和层析法等，以提高提取效率。
《RNA的提取》 PPT课件
目录
• RNA提取概述 • 实验材料准备 • RNA提取的方法 • RNA的质量检测 • RNA提取的常见问题及解决方案 • 实验结果分析
01 RNA提取概述
RNA的简介
总结词
RNA的基本信息
详细描述
RNA，全称为核糖核酸，是一种重要的生物分子，参与遗传信息的转录和翻译过程。它由核糖核苷酸通过磷酸二 酯键连接而成，分为mRNA、tRNA和rRNA三种类型，分别在蛋白质合成中起信使、转运和结构作用。
在提取过程中，应尽量保持低温，避免长时间暴露在高温 环境中；同时，控制好pH值，避免过酸或过碱环境对RNA 的破坏；此外，使用RNA酶抑制剂可以有效防止RNA被酶 降解。
提取过程中杂质的去除问题及解决方案
问题
在提取过程中，常常会伴随一些杂质 如蛋白质、多糖、色素等，这些杂质 会影响后续的实验结果。
谢谢聆听
酚-氯仿提取法
原理
利用酚和氯仿的混合液抽提细胞破碎后的上清液，使 RNA进入水相，而DNA和蛋白质则进入有机相。
01
步骤
样品匀浆→加酚-氯仿→离心取水相→ 加乙醇沉淀RNA→洗涤→溶解。
02
03
特点
酚-氯仿提取法是一种比较经典的方法 ，操作简便，但可能会损失部分RNA 。
DNA与RNA提取方法
DNA与RNA提取方法DNA及RNA提取的方法有很多种，常用的方法包括酚-氯仿法、离心法、磁珠法、膜结合法和柱式纯化法等。
酚-氯仿法是最早用于DNA与RNA提取的方法之一，它利用酚和氯仿的差异溶解力来分离DNA/RNA和蛋白质。
首先，将待提取的细胞裂解并加入含有酚的溶液中，酚能破坏细胞膜和核膜，使DNA/RNA释放到溶液中，然后加入氯仿，形成两相体系。
DNA/RNA会在两相之间进行分配，DNA/RNA会富集在上层的酚相中，而蛋白质则富集在下层的氯仿相中。
最后，利用离心将两相分离，然后从上层分离出DNA/RNA即可。
离心法是用于分离DNA/RNA和其他细胞组分的一种常见方法。
通过离心的方式来分离细胞组分，离心力可以使大分子的DNA/RNA和小分子的蛋白质等有差异的质量在离心仪中发生分离。
首先，将待提取的细胞离心，将细胞沉淀，然后将沉淀的细胞裂解，并加入适当的缓冲液使DNA/RNA释放到溶液中。
再次进行离心，使DNA/RNA沉淀到底部，上清液中只剩下其他细胞组分，最后将底部的DNA/RNA沉淀收集，即可得到纯化的DNA/RNA。
磁珠法是一种通过磁性珠子来选择性纯化DNA/RNA的方法，它的原理是磁性珠子上特定的配体能够与DNA/RNA结合。
首先，将待提取的细胞裂解，并加入磁性珠子，磁性珠子上的配体与DNA/RNA结合形成复合物，然后用磁力将复合物沉淀到底部，上清液中只剩下其他细胞组分。
然后，去除上清液，用适当的缓冲液洗涤磁性珠子上的复合物，最后用缓冲液溶解复合物，即可得到纯化的DNA/RNA。
膜结合法是一种通过特定质量的薄膜来选择性吸附DNA/RNA的方法。
膜上的小孔可以使DNA/RNA通过，而使大分子如蛋白质等无法通过。
首先将待提取的细胞裂解，并加入适当的缓冲液，使DNA/RNA完全释放到溶液中。
然后，将溶液滴在膜上，通过重力或离心使DNA/RNA通过膜上的小孔，将DNA/RNA捕获在膜上，上清液中只剩下其他细胞组分。
第六章DNA和RNA的提取
β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除
（二）基因组DNA的提取－ CTAB法
组份
CTAB提取缓冲液的改进配方
Tris-HCl EDTA NaCl （pH8.0） （pH8.0） 100 mM 20 mM 1.4M CTAB 3%(W/ V) PVP40 5%(W/ V) β-巯基乙醇 2%（V/V） 使用前加入
主要方法： (1)浓盐法 利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同，将二者分离。 1）用1M 氯化钠提取,得到的DNP粘液 2) 与含有少量异戊醇的氯仿一起摇荡,使乳化 3) 离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相 中间，而DNA位于上层水相中 4) 用2倍体积95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来.
质粒DNA的提取
使用处于对数期的新鲜菌体 （老化菌体导致开环质粒增加）
质粒DNA－碱裂解法
碱裂解法原理
染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分 子，而质粒DNA为共价闭合环状分子； 当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共 价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象； 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉 淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相 中，从而可通过离心将两者分开。
磁珠
磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的 物，从而达到分离目的。
（三）基因组DNA－其它方法
浓盐法：
利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离
有机溶剂抽提法：
有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用
密度梯度离心法：
利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物
分别提取动物组织中的DNA和RNA及核酸的定性分析-经典PPT课件
在不同浓度电解质中溶解度有明显差别
0.14M
2. 核酸与蛋白质的分离 DN
氯仿-异丙醇
P
极小
1M 大两倍
3. 核酸的沉淀
RN P
相当大 变化不大
目录
实验原理 （二）核酸的鉴定 1. 核酸的水解
RNA和DNA均可被硫酸水解生成含氮碱 （嘌呤碱与嘧啶碱）、戊糖（RNA中的核糖 与DNA中的脱氧核糖）和磷酸。
CH3
2H2O
核糖
HO
OH
3，5-二羟甲苯
HO
C O
CH3
O OH
H3C 绿色化合物
目录
2. 成分的鉴定
实验原理
（3）脱氧核糖的鉴定原理
CHO
CHO
CH2 浓H2SO4 CH2
CHOH
CH2
CHOH H2O C O
CH2OH
CH2OH
脱氧核糖
ω —羟基—γ —酮基戊醛
NH
二苯胺
蓝色化合物
目录
2. 成分的鉴定
目录
实验操作
2．分离提取 将上述肝匀浆全部倾入一支10ml刻度离心
管中，再用0.14M NaCl溶液分两次将研钵中 肝匀浆洗入离心管中，使离心管内总量不超过 5ml。用玻璃棒充分搅匀，放置10min ，离心 （3500r/min）5min。溶液分为两层。
目录
实验操作
2．分离提取 用滴管吸取上清液于另一离心管中，用于进一
目录
实验操作
2．分离提取 分别在上清液中加入1.5～2倍体积的冰冷
的95%乙醇。在分离提取DNA时，要边加边 用玻璃棒搅拌，此时纤维状的DNA缠绕在玻 璃棒上。当分离提取RNA时，轻轻搅拌，出现 乳白色絮状沉淀。分别离心（3500r/min） 5min，弃去上层乙醇液，沉淀为RNA或DNA
dna、rna共抽提
二、实验方法
将吸附柱放回收集管内，12,000 rpm 4℃离心2 min，离去残留的洗涤液。取出吸附柱，放入新的1.5 mL 离心管内，加入30-50 L 洗脱液，静置3 min,12,000 rpm 4℃ 离心2 min，收集DNA溶液。提取的DNA即可用于下一步实验或-20℃保存。
二、实验方法
对于已知病毒载量和病毒种类的样本，如果样本中只含有 DNA 病毒，提取液DNA 浓度≤105copies/μl 时，可以采用 OMEGA 试剂盒
若样本中只含有RNA 病毒，提取液RNA浓度≤108copies/μl时，可采用 QIAGEN试剂盒
提取液 DNA 浓度 ＞ 105 copies/μl 时，可以采用QIAGEN 试剂盒
利用某些固项介质，在某些特定的条件下，选择性地吸附核酸，而不吸附蛋白质及盐的特点，实现核酸与蛋白质及盐的分离。
二、实验方法
准备:无水乙醇、生理盐水、1.5mL离心管。取出析出液和洗涤液，按以下操作:a)析出液: 4.5mL加入25.5mL无水乙醇，混匀;9mL加入51mL无水乙醇，混匀。b)洗涤液: 9mL加入21mL无水乙醇，混匀;18mL加入42mL无水乙醇，混匀。c)配制好的析出液及洗涤液如出现沉淀，可在37C溶解，摇匀后使用。
经典的裂解液几乎都含有去污剂 (如 SDS、Triton X-100、NP-40、Tween 20 等)和盐(如 Tris、EDTA、NaCI 等)。
盐的作用：提供一个合适的裂解环境(如Tris)，抑制样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏(如EDTA)、维持核酸结构的稳定(如 NaCI)等。
去污剂：通过使蛋白质变性，破坏膜结构及解开与核酸相连接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系中。
裂解体系中加入蛋白酶:利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段，促进核酸与蛋白质的分开，也便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸。
DNA和RNA提取方法及原理
DNA和RNA提取方法及原理DNA提取方法：1.酚/氯仿方法：这是最早应用的DNA提取方法之一，适用于绝大多数生物样本。
原理是利用酚酸抽提DNA，酚酸能溶解细胞膜和蛋白质，而DNA在酚相沉淀。
然后用氯仿提取，分离DNA与酚相中的蛋白质和RNA。
最后通过乙醇沉淀纯化DNA。
这种方法可以得到高质量的DNA，但操作过程相对繁琐。
2.硅胶基质法：硅胶基质可吸附DNA，该方法使用硅胶膜或硅胶粉末来固定DNA，通过洗涤去除杂质，最后用洗脱液从硅胶上洗脱DNA。
这种方法具有简便和高纯度的优点，适用于大规模提取DNA。
3.盐酸法：盐酸法以酸性条件下使DNA变为不溶性沉淀物的原理，通过加入盐酸将DNA沉淀下来，然后经过洗涤和乙醇沉淀纯化。
这种方法适用于提取纯度要求不高的DNA。
RNA提取方法：1.酚酸提取法：这是最常用的RNA提取方法之一、原理类似于DNA的酚/氯仿法，通过酚酸将核酸与蛋白质和其他杂质分离。
然后通过氯仿脱脂，去除酚相中的蛋白质，并且获得RNA水相。
最后通过乙醇沉淀纯化RNA。
这种方法适用于大多数样品，得到的RNA纯度较高。
2.硅胶基质法：与DNA提取类似，它也适用于RNA的提取。
通过硅胶膜或硅胶粉末结合RNA并洗脱，用洗脱液分离RNA与杂质。
这种方法适用于大规模提取RNA。
3.氯仿法：这是一种较为简便的RNA提取方法，它通过氯仿脱脂去除脂质和其他杂质，并且能够同时去除DNA。
最后用乙醇沉淀纯化RNA。
这种方法适用于需要较快速提取RNA的情况。
DNA和RNA提取的基本原理都是通过分离和纯化DNA或RNA与其他杂质的物质。
酚酸提取法和硅胶基质法同属于酚酸法，都是通过酚酸和氯仿来分离DNA或RNA与蛋白质和其他杂质。
其中酚酸能溶解细胞膜和蛋白质，并且DNA或RNA在酚相中沉淀，而蛋白质和RNA在氯仿相中溶解。
然后通过洗脱和纯化步骤，从酚酸相中提取DNA或RNA。
盐酸法与酚酸法不同，它是通过酸性条件下使DNA变为不溶性沉淀物来分离DNA与其他杂质。
RNA与DNA提取
RNA与DNA提取一.DNA的提取方法简介为了研究DNA分子在生命代谢中的作用，常常需要从不同的生物材料中提取DNA.由于DNA分子在生物体内的分布及含量不同，要选择适当的材料提取DNA。
动植物中，小牛胸腺?动物肝脏?鱼类精子，植物种子的胚中都含有丰富的DNA。
微生物中，谷氨酸菌体含7%~10%，面包酵母含4%，啤酒酵母含6%，大肠肝菌含9%~10%。
从各种材料中提取DNA方法不同，分离提取的难易程度也不同。
对于低等生物。
如从病毒中提取DNA 比较容易，多数病毒DNA 分子量较小，提取时易保持其结构完整性。
从细菌及高等动植物中提取DNA难度大一些。
细菌DNA 分子量较大，一般达2×10 道尔顿。
因此易被机械张力剪断。
细菌DNA，除核DNA 外，还有质粒DNA 等。
1、核酸的理化性质RNA和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶，DNA则为白色类似石棉样的纤维状物。
除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外，核酸和核苷酸大都呈酸味。
DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。
DNA在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。
在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。
天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。
要从细胞中提取DNA 时，先把DNP抽提出来，再把P除去，再除去细胞中的糖，RNA及无机离子等，从中分离DNA 。
DNP和RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。
DNP在低浓度盐溶液中，几乎不溶解，如在0.14 mol/L的氯化钠溶解度最低，仅为在水中溶解度的1%，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化钠中的溶解度很大，比纯水高2倍。
RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在0.14mol/L氯化钠中溶解度较大。
因此，在提取时，常用此法分离这两种核蛋白。
最新DNA、RNA提取的差别
TRIzol试剂提取RNA、DNA
• TRIzol试剂有多组分分离作用,最大特点是可同时分离一个样品的 RNA\DNA\蛋白质．
• TRIzol使样品匀浆化, 因同时含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性. • 加入氯仿离心后,溶液分为水相和有机相
利用rnp和dnp在盐溶液中溶解度不同将二者分离有机溶剂作为蛋白变性剂同时抑制核酸酶的降解作用利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物吸附材料结合法碱裂解法密度梯度离心法煮沸法质粒dna的提取sds法流程图以动物组织为例动物组织细胞裂解上层溶液组织匀浆干燥溶解离心洗涤酒精沉淀dna溶液异硫氰酸胍苯酚法细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解同时核蛋白体上的蛋白变性核酸释放
RNA提取的通用方法
异硫氰酸胍/苯酚法
➢ 步骤: • 材料准备：尽量新鲜。 • 裂解变性：异硫氰酸胍（亚硫氢胍，巯基乙醇，N-月桂肌氨酸等）。
使细胞及核蛋白复合物变性，释放RNA，有效抑制核酸酶。
• 纯化分离：苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚/氯仿可抽提去除杂物。 • 洗涤：70％乙醇。 • 沉淀：异丙醇、无水乙醇。
•原因分析：裂解不充分，沉淀不完全，洗涤时DNA丢失 氯仿抽提不充分，洗涤不充分
结束语
谢谢大家聆听！！！
13
DNA、RNA提取的差别
核酸的理化性质
• 极性化合物，溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂， 钠盐比游离核酸易溶于水。
• 在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液 中较稳定。
• 天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于 细胞核中。
提取DNA、RNA总的原则 :
DNA与RNA提取方法
实验三Trizol法提取细菌总RNA一、实验原理Trizol主要物质是异硫氰酸胍,它可以破坏细胞使RNA释放出来的同时,保护RNA的完整性。
加入氯仿后离心,样品分成水样层和有机层。
RNA存在于水样层中。
收集上面的的水样层后RNA 可以通过异丙醇沉淀来还原。
无论是人、动物、植物还是细菌组织Trizol法对少量的组织(50-100 mg)和细胞(5×106)以及大量的组织(≧1 g)和细胞(>107)均有较好的分离效果。
Trizol试剂操作上的简单性允许同时处理多个的样品。
所有的操作可以在一小时内完成。
Trizol抽提的总RNA能够避免DNA和蛋白的污染。
主要试剂和器材Trizol 溶液氯仿异丙醇75%乙醇0.1% DEPC水超净工作台 2.0 mL离心管无Rnase移液枪紫外分光光度计石英比色皿泳槽和模具电泳仪凝胶成像系统大肠杆菌实验步骤一. 采用Trizol 溶液提取细菌的总RNA挑取大肠杆菌菌单菌落培养至稳定期取菌液2.0 mL 于2.0 mL离心管离心得菌体2、每管加入1 mL Trizol 溶液盖紧管盖激烈振荡15 s室温静置5 min 4℃12000 g离心10 min取上清转入(约 1 mL)新的2.0 m L离心管中每管加入0.2 mL 的氯仿(0.2 体积Trizol)盖紧盖剧烈振荡15 s室温静置3 min4℃, 12000 g, 离心10 min，小心吸取上层水相转入另一新的2.0mL 离心管，测量其体积,加氯仿时应充分震荡使其充分乳化。
加入1倍体积的氯仿，盖紧盖，剧烈振荡15 s，室温静置3 min，4℃12000 g离心10 min 小心吸取上层水相，转入另一已编号新的2.0mL 离心管。
加入0.5 mL 的异丙醇(0.5 体积Trizol)轻轻颠倒混匀，室温静置10 min，4℃12000 g离心10 min，RNA 沉于管底，小心吸去上清6、加1 mL75%的乙醇(预冷),并轻柔颠倒，洗涤沉淀4℃7500 g离心5 min,小心弃上清，微离吸去剩余乙醇，室温干躁10 min。
DNA的提取与鉴定讲解ppt课件
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4.DNA的再溶解。 用高浓度（2mol/L）的氯化钠溶液再溶解DNA粘稠物。
5.DNA的沉淀和浓缩。
对于除去了蛋白质的DNA的氯化钠溶液，必须再进 一步沉淀和浓缩，常用酒精沉淀法。即往含有Na＋的 DNA溶液，加入体积分数为95%的冷却酒精，混匀后可 以使DNA沉淀、浓缩，形成含杂质较少的DNA丝状物， 悬浮于溶液中。若丝状物较少，可将混合液再放入冰 箱中冷却几分钟即可。浓缩后的DNA丝状物可以用玻棒 （玻棒有吸附DNA的作用）缓缓旋转的方法卷起。
3.DNA的鉴定： 加入二苯胺试剂4mL，用玻棒搅拌使DNA溶解，沸水 浴5min，观察溶液是否出现浅蓝色。
三、实验小结
1.共有“三次过滤，两次析出，七次搅拌”
2.加入“两次蒸馏水，三次NaCl溶液，一次酒精”
四、实验原理拓展介绍。
1.DNA的释放。 DNA主要在鸡血细胞的细胞核内，正常情况下不会释 放出来，蒸馏水对于鸡血细胞是一种低渗液，水分可以 大量进入血细胞，使之胀破，同时加上玻璃棒快速搅拌 的机械作用，加速血细胞的细胞膜和核膜的破裂。但释 放出来的大量DNA与RNA、蛋白质结合在一起，即释放 的不是纯净的DNA，常称为DNA核蛋白。 2.DNA与蛋白质分离。 在高浓度（2mol/L）的氯化钠溶液中，核蛋白易溶解， 析出DNA并溶解在高浓度的氯化钠溶液中 3.DNA的析出与获取。 因为DNA在低浓度（ 0.14mol/L ）的氯化钠溶液中溶解 度小，而蛋白质的在其中的溶解度大。所以在向含DNA 的高浓度的氯化钠溶液中加入大量蒸馏水稀释氯化钠溶 液，从而使DNA溶解度下降，蛋白质溶解度增高。
RNA的提取和cDNA合成原理和实验方法
RNA的提取和cDNA合成原理和实验方法第一节. 概述从真核生物的组织或细胞中提取mRNA,通过酶促反响逆转录合成cDNA的第一链和第二链,将双链cDNA和载体连接,然后转化扩增, 即可获得cDNA文库,构建的cDNA文库可用于真核生物基因的构造、表达和调控的分析;比拟cDNA和相应基因组DNA序列差异可确定含子存在和了解转录后加工等一系列问题。
总之cDNA的合成和克隆已成为当今真核分子生物学的根本手段。
自70年代中叶首例cDNA克隆问世以来,已开展了许多种提高cDNA合成效率的方法,并大大改良了载体系统，目前cDNA合成试剂已商品化。
cDNA合成及克隆的根本步骤包括用反转录酶合成cDNA第一链,聚合酶合成cDNA第二链,参加合成接头以及将双链DNA克隆到于适当载体(噬菌体或质粒)。
一.RNA制备模板mRNA的质量直接影响到cDNA合成的效率。
由于mRNA分子的构造特点,容易受RNA 酶的攻击反响而降解,加上RNA酶极为稳定且广泛存在,因而在提取过程中要严格防止RNA 酶的污染,并设法抑制其活性,这是本实验成败的关键。
所有的组织中均存在RNA酶,人的皮肤、手指、试剂、容器等均可能被污染，因此全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换〔使用一次性手套〕。
所用的玻璃器皿需置于枯燥烘箱中200℃烘烤2小时以上。
但凡不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理,再用蒸馏水冲净。
DEPC是RNA酶的化学修饰剂,它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反响而抑制酶活性。
DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物,因而使用时需小心。
试验所用试剂也可用DEPC处理,参加DEPC至0.1%浓度,然后剧烈振荡10分钟,再煮沸15分钟或高压灭菌以消除残存的DEPC,否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活性。
但DEPC能与胺和巯基反响,因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理。
Tris溶液可用DEPC处理的水配制然后高压灭菌。
分离dna和rna的方法及其原理
分离dna和rna的方法及其原理嘿，咱今儿就来讲讲分离 DNA 和 RNA 的那些事儿！你可别小瞧这分离的活儿，这里头学问大着呢！先来说说 DNA 吧，那可是生命的密码呀！要把它从一堆细胞混合物里给揪出来，就像是在茫茫人海中找到那个特别的人。
那怎么找呢？这就有办法啦！比如说沉淀法，就好像是让 DNA 自己慢慢沉淀下来，就像沙子在水里会沉底一样。
通过一些特殊的试剂，让其他杂质飘走，DNA 就乖乖地留下来啦。
这不是挺神奇的嘛！还有离心法，把混合液放到离心机里，“呼呼”一转，DNA 就被甩到一边去了，就像把不同的东西用大力气给分开一样。
再讲讲 RNA 呀，它也很重要呢！分离 RNA 的方法也有不少。
有一种方法是利用它和其他物质亲和力的不同，就好比人和人之间关系有亲有疏。
通过合适的条件，让 RNA 紧紧抓住我们想要它抓住的东西，其他的就可以被洗掉啦。
你想想看，细胞里那么多东西，要把 DNA 和 RNA 准确地分离出来，这得多不容易呀！这就好像在一个大杂烩里，要精准地挑出特定的豆子和米粒一样。
这些方法背后的原理呢，其实就是利用它们各自的特性。
DNA 和RNA 有着不同的化学性质和物理性质，我们就根据这些来想办法把它们分开。
就像每个人都有自己的特点，我们根据这些特点来区分不同的人一样。
在实验室里，科学家们就像是侦探，通过各种巧妙的方法和技术，一点点地把 DNA 和 RNA 从复杂的体系中分离出来。
这可不只是简单的操作，这是在探索生命的奥秘呀！而且哦，这些分离方法可不是随便弄弄就行的，得特别精细、特别小心。
要是不小心弄错了一步，那可能就前功尽弃啦！这可真是一点都马虎不得呢。
你说，这分离 DNA 和 RNA 的事儿是不是特别有意思？它们就像藏在细胞里的宝贝，等着我们去发现、去挖掘。
咱可得好好了解了解这些方法和原理，说不定哪天我们自己也能动手试试呢！这难道不令人兴奋吗？这就是科学的魅力呀，总是能让我们看到那些隐藏在微小世界里的奇妙之处。
DNA和RNA提取方法及原理
4. 小心操作
第30页/共45页
RNA提取专题
第一部分：RNA提取方法简介 第二部分：RNA提取及常见问题分析
第31页/共45页
分离提纯RNA的目的
➢ 分析不同发育时期基因的表达状况 ➢ 获得新基因 ➢ 研究基因的拼接 ➢ 分析相应的蛋白产物
第32页/共45页
RNA的不稳定性
CTAB提取缓冲液的改进配方
➢ PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合
物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合， 有效去除多糖。
第7页/共45页
基因组DNA－ CTAB法
CTAB法流程图
植物材料
裂解液
酒精沉淀
液氮研磨抽提Fra bibliotek离心洗涤
DNA溶液
细胞裂解
➢ 当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共 价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象；
➢ 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉 淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相 中，从而可通过离心将两者分开。
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质粒DNA－碱裂解 法
碱裂解法流程图
差速离心法原理
➢ 是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。
➢ 将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进 行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层， 从而得以分离。
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内容
第一部分：DNA提取方法简介 第二部分：DNA提取及常见问题分析
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DNA提取的基本步 骤
➢氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它 和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活 性。
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基因组DNA－ CTAB法
CTAB提取缓冲液的经典配方
➢ Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； ➢ EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； ➢ NaCl 提供一个高盐环境，使DNP（脱氧核糖核蛋白 ）。CTAB溶解细胞膜，
并结合核酸，使核酸便于分离；
基因组DNA－SDS法
SDS法流程图 （以动物组织为例）
动物组织
抽提
离心洗涤
组织DNA溶液
根据细胞裂解方式的不同有：
➢ 物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法 ➢ 化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法 ➢ 生物方式：酶法
根据核酸分离纯化方式的不同有：
➢ 提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖 杂质沉淀，离心后除去沉淀；
➢ 上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的 DNA。
SDS法DNA提取缓冲液
2.65 水浴 60min, 其间缓慢摇动几次。 3.加入150ul 的5mol/ LKac, 混匀, 冰浴15min 左右
➢ 线粒体、叶绿体DNA的提取 • 差速离心结合SDS裂解法
基因组DNA－ CTAB法
CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）
➢ CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基 溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合 物。
➢ 具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在这种条 件下，蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里
➢ 该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂 抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离 出来。
注：CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。
大家应该也有点累了，稍作休息
大家有疑问的，可以询问和交流
PVP 按其平均分子量大小分为四级，习惯上常以 K值表示，不同的K值分别代表相应的PVP平均分 子量范围。K值实际上是与PVP水溶液的相对粘度 有关的特征值，而粘度又是与高聚物分子量有关的 物理量，因此可以用K值来表征PVP的平均分子量。 通常K值越大，其粘度越大，粘接性越强。
在研磨过程中加入PVP，其中的CO-N=基有很强的 结合多酚的能力，从源头上减少了酚类被氧化的机 会。
溶液Ⅰ 50mM 葡萄糖 / 10mM EDTA / 25mM Tris-HCl， pH=8.0 葡萄糖增稠，使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉 积到管子的底部；EDTA 抑制DNase的活性。这一步溶 液中还可以加入RNase，不受EDTA影响，并且可以在 后续步骤中被除去
溶液Ⅱ 0.2M NaOH / 1% SDS 破细胞的主要是碱，而 不是SDS，所以才叫碱法抽提。
➢ 吸附材料结合法：
• 硅质材料
高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。 快捷高效。
• 阴离子交换树脂 低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。
适用于纯度要求高的实验。
• 磁珠
磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的 物，从而达到分离目的。
➢ 浓盐法：
利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离
DNA和RNA提取原理和方法
内容
第一部分：DNA提取方法简介
第二部分：DNA提取常见问题、 原因分析及其对策
第三部分：RNA提取方法简介
第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见 问题、原因分析及其对策
前言
核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物 信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因 此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、 最基本的操作 。
➢ 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉 淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相 中，从而可通过离心将两者分开。
质粒DNA－碱裂解法
碱裂解法流程图
对数期菌体
上清液
沉淀
溶液I充分重悬
抽提
干燥溶解
溶液II裂解 溶液III中和
酒精沉淀 离心洗涤
质粒DNA溶液
SDS碱裂解法提取质粒DNA中溶液1的成分 及作用
第一部分：DNA提取方法简介
第二部分：DNA提取常见问题、 原因分析及其对策
第三部分：RNA提取方法简介
第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见 问题、原因分析及其对策
DNA提取的几种方法
基因组DNA的提取
➢ CTAB法 ➢ SDS法 ➢ 其它
DNA提取的几种方法
非基因组DNA的提取 ➢ 质粒DNA的提取 • 碱裂解法 • 煮沸法
溶液III 3M 醋酸钾 / 2M 醋酸
这一步的K置换了SDS（十二烷基磺酸钠）中的Na，得 到PDS（十二烷基磺酸钾）沉淀；SDS易与蛋白质结合， 平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所 产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质也沉淀了，同 时基因组DNA也被PDS共沉淀
同时向抽提液中加入还原剂β-巯基乙醇，后者能打 断多酚氧化酶中的二硫键，使多酚不易被氧化，随 后经抽提而去除。
基因组DNA－ CTAB法
CTAB法流程图
植物材料
裂解液
酒精沉淀
液氮研磨
抽提
离心洗涤
DNA溶液
细胞裂解
上层溶液
干燥溶解
基因组DNA－SDS法
SDS法原理
➢ SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能裂解细 胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；
➢ β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除
褐变
基因组DNA－ CTAB法
CTAB提取缓冲液的改进配方
❖ PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶
的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能 和多糖结合，有效去除多糖。
PVP（聚乙烯吡咯烷酮）
➢ 有机溶剂抽提法：
有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用
➢ 密度梯度离心法：
利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物
质粒DNA－碱裂解法
碱裂解法原理
➢ 染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分 子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；
➢ 当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共 价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象；