DNA和RNA提取原理和方法 PPT
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溶液III 3M 醋酸钾 / 2M 醋酸
这一步的K置换了SDS（十二烷基磺酸钠）中的Na，得 到PDS（十二烷基磺酸钾）沉淀；SDS易与蛋白质结合， 平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所 产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质也沉淀了，同 时基因组DNA也被PDS共沉淀
PVP 按其平均分子量大小分为四级，习惯上常以 K值表示，不同的K值分别代表相应的PVP平均分 子量范围。K值实际上是与PVP水溶液的相对粘度 有关的特征值，而粘度又是与高聚物分子量有关的 物理量，因此可以用K值来表征PVP的平均分子量。 通常K值越大，其粘度越大，粘接性越强。
在研磨过程中加入PVP，其中的CO-N=基有很强的 结合多酚的能力，从源头上减少了酚类被氧化的机 会。
➢ 提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖 杂质沉淀，离心后除去沉淀；
➢ 上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的 DNA。
SDS法DNA提取缓冲液
2.65 水浴 60min, 其间缓慢摇动几次。 3.加入150ul 的5mol/ LKac, 混匀, 冰浴15min 左右
第一部分：DNA提取方法简介
第二部分：DNA提取常见问题、 原因分析及其对策
第三部分：RNA提取方法简介
第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见 问题、原因分析及其对策
DNA提取的几种方法
基因组DNA的提取
➢ CTAB法 ➢ SDS法 ➢ 其它
DNA提取的几种方法
非基因组DNA的提取 ➢ 质粒DNA的提取 • 碱裂解法 • 煮沸法
➢ 线粒体、叶绿体DNA的提取 • 差速离心结合SDS裂解法
基因组DNA－ CTAB法
CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）
➢ CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ基 溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合 物。
➢ 具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在这种条 件下，蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里
➢ 该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂 抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离 出来。
注：CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。
大家应该也有点累了，稍作休息
大家有疑问的，可以询问和交流
➢ β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除
褐变
基因组DNA－ CTAB法
CTAB提取缓冲液的改进配方
❖ PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶
的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能 和多糖结合，有效去除多糖。
PVP（聚乙烯吡咯烷酮）
溶液Ⅰ 50mM 葡萄糖 / 10mM EDTA / 25mM Tris-HCl， pH=8.0 葡萄糖增稠，使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉 积到管子的底部；EDTA 抑制DNase的活性。这一步溶 液中还可以加入RNase，不受EDTA影响，并且可以在 后续步骤中被除去
溶液Ⅱ 0.2M NaOH / 1% SDS 破细胞的主要是碱，而 不是SDS，所以才叫碱法抽提。
➢ 吸附材料结合法：
• 硅质材料
高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。 快捷高效。
• 阴离子交换树脂 低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。
适用于纯度要求高的实验。
• 磁珠
磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的 物，从而达到分离目的。
➢ 浓盐法：
利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离
DNA和RNA提取原理和方法
内容
第一部分：DNA提取方法简介
第二部分：DNA提取常见问题、 原因分析及其对策
第三部分：RNA提取方法简介
第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见 问题、原因分析及其对策
前言
核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物 信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因 此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、 最基本的操作 。
➢ 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉 淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相 中，从而可通过离心将两者分开。
质粒DNA－碱裂解法
碱裂解法流程图
对数期菌体
上清液
沉淀
溶液I充分重悬
抽提
干燥溶解
溶液II裂解 溶液III中和
酒精沉淀 离心洗涤
质粒DNA溶液
SDS碱裂解法提取质粒DNA中溶液1的成分 及作用
基因组DNA－ CTAB法
CTAB提取缓冲液的经典配方
➢ Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； ➢ EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； ➢ NaCl 提供一个高盐环境，使DNP（脱氧核糖核蛋白 ）。CTAB溶解细胞膜，
并结合核酸，使核酸便于分离；
基因组DNA－SDS法
SDS法流程图 （以动物组织为例）
动物组织
抽提
离心洗涤
组织匀浆
上层溶液
干燥溶解
细胞裂解
酒精沉淀
DNA溶液
根据细胞裂解方式的不同有：
➢ 物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法 ➢ 化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法 ➢ 生物方式：酶法
根据核酸分离纯化方式的不同有：
同时向抽提液中加入还原剂β-巯基乙醇，后者能打 断多酚氧化酶中的二硫键，使多酚不易被氧化，随 后经抽提而去除。
基因组DNA－ CTAB法
CTAB法流程图
植物材料
裂解液
酒精沉淀
液氮研磨
抽提
离心洗涤
DNA溶液
细胞裂解
上层溶液
干燥溶解
基因组DNA－SDS法
SDS法原理
➢ SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能裂解细 胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；
➢ 有机溶剂抽提法：
有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用
➢ 密度梯度离心法：
利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物
质粒DNA－碱裂解法
碱裂解法原理
➢ 染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分 子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；
➢ 当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共 价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象；
这一步的K置换了SDS（十二烷基磺酸钠）中的Na，得 到PDS（十二烷基磺酸钾）沉淀；SDS易与蛋白质结合， 平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所 产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质也沉淀了，同 时基因组DNA也被PDS共沉淀
PVP 按其平均分子量大小分为四级，习惯上常以 K值表示，不同的K值分别代表相应的PVP平均分 子量范围。K值实际上是与PVP水溶液的相对粘度 有关的特征值，而粘度又是与高聚物分子量有关的 物理量，因此可以用K值来表征PVP的平均分子量。 通常K值越大，其粘度越大，粘接性越强。
在研磨过程中加入PVP，其中的CO-N=基有很强的 结合多酚的能力，从源头上减少了酚类被氧化的机 会。
➢ 提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖 杂质沉淀，离心后除去沉淀；
➢ 上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的 DNA。
SDS法DNA提取缓冲液
2.65 水浴 60min, 其间缓慢摇动几次。 3.加入150ul 的5mol/ LKac, 混匀, 冰浴15min 左右
第一部分：DNA提取方法简介
第二部分：DNA提取常见问题、 原因分析及其对策
第三部分：RNA提取方法简介
第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见 问题、原因分析及其对策
DNA提取的几种方法
基因组DNA的提取
➢ CTAB法 ➢ SDS法 ➢ 其它
DNA提取的几种方法
非基因组DNA的提取 ➢ 质粒DNA的提取 • 碱裂解法 • 煮沸法
➢ 线粒体、叶绿体DNA的提取 • 差速离心结合SDS裂解法
基因组DNA－ CTAB法
CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）
➢ CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ基 溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合 物。
➢ 具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在这种条 件下，蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里
➢ 该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂 抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离 出来。
注：CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。
大家应该也有点累了，稍作休息
大家有疑问的，可以询问和交流
➢ β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除
褐变
基因组DNA－ CTAB法
CTAB提取缓冲液的改进配方
❖ PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶
的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能 和多糖结合，有效去除多糖。
PVP（聚乙烯吡咯烷酮）
溶液Ⅰ 50mM 葡萄糖 / 10mM EDTA / 25mM Tris-HCl， pH=8.0 葡萄糖增稠，使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉 积到管子的底部；EDTA 抑制DNase的活性。这一步溶 液中还可以加入RNase，不受EDTA影响，并且可以在 后续步骤中被除去
溶液Ⅱ 0.2M NaOH / 1% SDS 破细胞的主要是碱，而 不是SDS，所以才叫碱法抽提。
➢ 吸附材料结合法：
• 硅质材料
高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。 快捷高效。
• 阴离子交换树脂 低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。
适用于纯度要求高的实验。
• 磁珠
磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的 物，从而达到分离目的。
➢ 浓盐法：
利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离
DNA和RNA提取原理和方法
内容
第一部分：DNA提取方法简介
第二部分：DNA提取常见问题、 原因分析及其对策
第三部分：RNA提取方法简介
第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见 问题、原因分析及其对策
前言
核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物 信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因 此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、 最基本的操作 。
➢ 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉 淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相 中，从而可通过离心将两者分开。
质粒DNA－碱裂解法
碱裂解法流程图
对数期菌体
上清液
沉淀
溶液I充分重悬
抽提
干燥溶解
溶液II裂解 溶液III中和
酒精沉淀 离心洗涤
质粒DNA溶液
SDS碱裂解法提取质粒DNA中溶液1的成分 及作用
基因组DNA－ CTAB法
CTAB提取缓冲液的经典配方
➢ Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； ➢ EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； ➢ NaCl 提供一个高盐环境，使DNP（脱氧核糖核蛋白 ）。CTAB溶解细胞膜，
并结合核酸，使核酸便于分离；
基因组DNA－SDS法
SDS法流程图 （以动物组织为例）
动物组织
抽提
离心洗涤
组织匀浆
上层溶液
干燥溶解
细胞裂解
酒精沉淀
DNA溶液
根据细胞裂解方式的不同有：
➢ 物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法 ➢ 化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法 ➢ 生物方式：酶法
根据核酸分离纯化方式的不同有：
同时向抽提液中加入还原剂β-巯基乙醇，后者能打 断多酚氧化酶中的二硫键，使多酚不易被氧化，随 后经抽提而去除。
基因组DNA－ CTAB法
CTAB法流程图
植物材料
裂解液
酒精沉淀
液氮研磨
抽提
离心洗涤
DNA溶液
细胞裂解
上层溶液
干燥溶解
基因组DNA－SDS法
SDS法原理
➢ SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能裂解细 胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；
➢ 有机溶剂抽提法：
有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用
➢ 密度梯度离心法：
利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物
质粒DNA－碱裂解法
碱裂解法原理
➢ 染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分 子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；
➢ 当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共 价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象；