分子荧光和磷光光谱PPT课件
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第十一章 分子发光―荧光、 磷光和化学发光光谱法Molecular .
已逐步形成一支在这个研究领域中的工作队伍，研究内
容2已020从/6/15经典的荧光分析方扩展到新近发展起来的新技术。
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§11－1 分子荧光和磷光光谱法
1．产生机理
在一般温度下，大多数分子处在基态的最低振动 能级。处于基态的分子吸收能量(电能、热能、化 学能或光能等到)后天激发为激发态。激发态是很 不稳定的，它得很快地释放出能量又重新跃迁回 基态。若分子返回基态时以发射的电磁辐射(即光) 的形式释放能量，就称为“发光”；如果物质的 分子吸收了光能而被激发，跃迁回基态所发射的 电磁辐射，称为荧光和磷光。现从分子结构理论 来讨论荧光和磷光的产生机理。
进入二十世纪以后，荧光现象被研究得更多了，在理论 或实验技术上都得到极大的发展。特别是随着激光、计 算机和电子学的新成就及技术的引入，大大推动了荧光 分析法在理论上及实验技术的发展，出现了许多新的理 论和新的方法。
在我国，二十世纪五十年代初期仅有极少数的分析工作
者从事荧光分析方面的研究工作。到了 下一张幻灯片
磷光也是某些物质受紫外光照射后产生的光。1944年 Lewis和Kasha提出了磷光与荧光的不同概念，指出磷光 是分子从亚稳的激发三重态跃迁回基态所发射出的光， 它有别于从激发单态跃迁回基态所发射的荧光。磷光分 析法由于其有某些特点，几十年来的理论研究及应用也 不断得到发展。
2020/6/15
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处于分子基态单重态的分子轨道上的电子，激发 时不能直接跃迁至第一激发三重态轨道上（不符 合光谱选择定则），但处于单重激发态的轨道上 的电子，可以通过体系跨越（系间窜跃），转移 到三重态轨道上；在这个过程中，处于激发态的 电子自旋发生变化，这个过程需要时间较长，故 处于三重激发态的寿命为10－4~1s；当其由三重激 发态的最低振动能级跃迁回基态时产生磷光。
分子荧光和磷光光谱分析法61页PPT
▪
26、要使整个人生都过得舒适、愉快，这是不可能的，因为人类必须具备一种能应付逆境的态度。——卢梭
▪
27、只有把抱怨环境的心情，化为上进的力量，才是成功的保证。——罗曼·罗兰
▪
28、知之者不如好之者，好之者不如乐之者。——孔子
33、如果惧怕前面跌宕的山岩，生命 就永远 只能是 死水一 潭。 34、当你眼泪忍不住要流出来的时候 ，睁大 眼睛， 千万别 眨眼!你会看到 世界由 清晰变 模糊的 全过程 ，心会 在你泪 水落下 的那一 刻变得 清澈明 晰。盐 。注定 要融化 的，也 许是用 眼泪的 方式。
35、不要以为自己成功一次就可以了 ，也不 要以为 过去的 光荣可 能够抵得上武器的精良。——达·芬奇
▪
30、意志是一个强壮的盲人，倚靠在明眼的跛子肩上。——叔本华
谢谢！
61
分子荧光和磷光光谱分析法
31、别人笑我太疯癫，我笑他人看不 穿。(名 言网) 32、我不想听失意者的哭泣，抱怨者 的牢骚 ，这是 羊群中 的瘟疫 ，我不 能被它 传染。 我要尽 量避免 绝望， 辛勤耕 耘，忍 受苦楚 。我一 试再试 ，争取 每天的 成功， 避免以 失败收 常在别 人停滞 不前时 ，我继 续拼搏 。
《分子发光光谱》PPT课件
共振荧光(Resonance)：
λex = λem
2020/12/31
h
7
电子重态示意图
基态单重态
激发单重态
激发三重态
2020/12/31
h
8
• 分子中电子的运动状态除了电子所处的能级外， 还包含有电子的多重态，用M=2S+1表示，S 为各电子自旋量子数的代数和，其数值为0或1
• 根据Pauli不相容原理，分子中同一轨道所占 据的两个电子必须具有相反的自旋方向，即自 旋配对Βιβλιοθήκη 2020/12/31h
6
（一）荧光磷光的产生
分子发光的类型
按激发的模式分类： 分子发光
按分子激发态的类型分类：
按光子能量分类：
分子发光
光致发光 化学发光/生物发光 热致发光 场致发光 摩擦发光
荧光 瞬时荧光 迟滞荧光
磷光
斯托克斯荧光(Stokes)：
λex < λem
荧光 反斯托克斯荧光 (Antistokes)：λex > λem
• 辐射跃迁主要涉及到荧光、延迟荧光或磷光的 发射
• 无辐射跃迁是指以热的形式释放多余的能量， 包括振动弛豫、内(部)转移、系间跨(窜)越及 外(部)转移等过程
2020/12/31
h
14
荧光和磷光的产生过程中能量 传递方式及作用
• 振动弛豫 • 内转移 • 荧光发射 • 系间窜跃 • 磷光发射 • 外转移 • 延迟荧光
2020/12/31
h
3
• 直到1852年，对荧光分析法具有开拓性工作的 Stokes在考察奎宁和绿色素的荧光时，用分光 计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍为长 些，而不是由光的漫反射引起的，从而导入荧 光是光发射的概念，他还由发荧光的矿石“萤 石”推演而提出了“荧光”这一术语，他还研 究了荧光强度与荧光物质浓度之间的关系，并 描述了在高浓度或某些外来物质存在时的荧光 猝灭现象
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分子能级和跃迁
电子能级、振动能级和转动能级 基态（S0）→激发态(S1、S2、激发态振动能 级）：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一 次到位； 激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)； 速度最快、激发态寿命最短的途径占优势；
2021/3/9
授课：XXX
10
荧光和磷光的产生过程
电子激发态的多重度
单重态S 三重态T 大多数有机分子的基态处于单重态 三重态能级比相应单重态能级低
发射的光量子数
吸收的光量子数
荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数 有关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射
9s。
由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；
l ‘2 > l 2 > l 1 ；
磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态 （ T1 → S0跃迁）； 电子由S0进入T1的可能过程：（ S0 → T1禁阻跃迁） S0 →激发→振动弛豫→内转移→系间跨越→振动弛豫→ T1 发光速度很慢： 10-4～100 s 。
2021/3/9
室 温 下 菲 的 乙 醇 溶 液授课荧：XX（X 磷 ） 光 光 谱
18
激发光谱和发射光谱关系
Stokes位移
激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波 长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。
发射光谱的形状与激发波长无关
电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如
ห้องสมุดไป่ตู้
能级图l 2 ,l 1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发
3
荧光
1852年，Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光 计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍为长些，才判明这 种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光。他 还由发荧光的矿物“萤石”推演而提出“荧光”这一术语.
入射光
荧光
2021/3/9
授课：XXX
4
萤石
纯净的萤石为无色，但因含有较多Y、Ce 等元素，造成萤石结构空位，
2021/3/9
授课：XXX
6
绿色荧光蛋白
GFP 绿色荧光蛋白
2021/3/9
授课：XXX
7
GFP
2021/3/9
授课：XXX
8
Generation of Molecular Fluorescence and Phosphorescence
原理
2021/3/9
授课：XXX
9
荧光和磷光的产生过程
单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一
定的荧光(如l
‘ 2
)。
镜像规则
通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状 一样）成镜像对称关系。
2021/3/9
授课：XXX
19
镜像规则
基态上的各振动能级分布 与第一激发态上的各振动能级 分布类似；
基态上的
零振动能级与
第一激发态的
二振动能级之
间的跃迁几率
激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，
发光强度相对大；
荧光：10-7～10 -9 s,第一激发单重态的最低振动能级→基态；
磷光：10-4～10s；第一激发三重态的最低振动能级→基态；
2021/3/9
授课：XXX
12
能级图
内转换
振动弛豫
内转换
S2
系间跨越
S1
能 量
吸 收
发
射
外转换
荧
光
T1 T2
产生色心而致色，常见的颜色有浅绿色至深绿色，蓝、绿蓝、黄、酒黄、
20紫21/3、/9 紫罗兰色、灰、褐、玫瑰红、深授红课：等XX。X
5
2001年美国遭受911袭击时，美国世贸大厦内一共 有2万5千多人，人们惊讶地发现了一个世界都为之惊 叹的纪录：两座大楼里，1万8千多人在上百层的大楼 完全断电的情况下，在一个半小时之内成功逃生。
S0→T1 禁阻跃迁； 通过其他途径进入
(见能级图)；进入的 几率小；
2021/3/9
授课：XXX
11
激发态→基态的能量传递途径
电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁 (发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；
传递途径
辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光 延迟荧光 磷光
系间跨越 内转移 外转移 振动弛豫
分子荧光和磷光光谱
2021/3/9
授课：XXX
1
内容(contents)
原理
分子荧光与磷光产生过程 激发光谱与荧光光谱 荧光的产生与分子结构关系 影响荧光强度的因素
仪器 应用
2021/3/9
授课：XXX
2
发光现象
起因
是吸收了外在提供的能量引起的
外在的能量
热 电 光 化学能
2021/3/9
授课：XXX
最大，相反跃
20迁21/3也/9 然。
授课：XXX
20
镜像规则
荧光激发光谱
荧光发射光谱
200
250
300
350 400
450
500
nm
蒽的激发光谱和荧光光谱
2021/3/9
授课：XXX
21
分子产生荧光的条件
分子产生荧光必须具备的条件
具有合适的结构（强的紫外可见吸收） 具有一定的荧光量子产率
荧光量子产率（）
外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。 系间跨越：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。
改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋—轨道耦合进行。
2021/3/9
授课：XXX
14
辐射能量传递过程
荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态
（ 多为 S1→ S0跃迁），发射波长为 l ‘2的荧光； 10-7～10 -
发
射
磷 光
振动弛豫
S0
l3
2021/3/9
l1
l2
l授2课：XXX
13
非辐射能量传递过程
振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级 至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12s。 内转换：同多重度电子能级中,等能级间的无辐射能级交换。
通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一 激发单重态的最低振动能级。 外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转 移能量的非辐射跃迁；
2021/3/9
授课：XXX
16
荧光（磷光）光谱
固定激发光波长(选最大 激发波长), 化合物发射 的荧光(或磷光强度)与 发射光波长关系曲线(图 中曲线II或III)。
2021/3/9
授课：XXX
17
光谱例子
荧光发射光谱 磷光光谱 荧光激发光谱
200 260 320 380 440 500 560 620
光照停止后，可持续一段时间。
2021/3/9
授课：XXX
15
激发光谱
荧光(磷光)：光致发光，照射光波长如何 选择？ 荧光(磷光)的激发光谱曲线
固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的 荧光(磷光)强度与照射光波长的关系曲线（图 中曲线I） 激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最 多，荧光强度最大；
电子能级、振动能级和转动能级 基态（S0）→激发态(S1、S2、激发态振动能 级）：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一 次到位； 激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)； 速度最快、激发态寿命最短的途径占优势；
2021/3/9
授课：XXX
10
荧光和磷光的产生过程
电子激发态的多重度
单重态S 三重态T 大多数有机分子的基态处于单重态 三重态能级比相应单重态能级低
发射的光量子数
吸收的光量子数
荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数 有关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射
9s。
由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；
l ‘2 > l 2 > l 1 ；
磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态 （ T1 → S0跃迁）； 电子由S0进入T1的可能过程：（ S0 → T1禁阻跃迁） S0 →激发→振动弛豫→内转移→系间跨越→振动弛豫→ T1 发光速度很慢： 10-4～100 s 。
2021/3/9
室 温 下 菲 的 乙 醇 溶 液授课荧：XX（X 磷 ） 光 光 谱
18
激发光谱和发射光谱关系
Stokes位移
激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波 长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。
发射光谱的形状与激发波长无关
电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如
ห้องสมุดไป่ตู้
能级图l 2 ,l 1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发
3
荧光
1852年，Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光 计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍为长些，才判明这 种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光。他 还由发荧光的矿物“萤石”推演而提出“荧光”这一术语.
入射光
荧光
2021/3/9
授课：XXX
4
萤石
纯净的萤石为无色，但因含有较多Y、Ce 等元素，造成萤石结构空位，
2021/3/9
授课：XXX
6
绿色荧光蛋白
GFP 绿色荧光蛋白
2021/3/9
授课：XXX
7
GFP
2021/3/9
授课：XXX
8
Generation of Molecular Fluorescence and Phosphorescence
原理
2021/3/9
授课：XXX
9
荧光和磷光的产生过程
单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一
定的荧光(如l
‘ 2
)。
镜像规则
通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状 一样）成镜像对称关系。
2021/3/9
授课：XXX
19
镜像规则
基态上的各振动能级分布 与第一激发态上的各振动能级 分布类似；
基态上的
零振动能级与
第一激发态的
二振动能级之
间的跃迁几率
激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，
发光强度相对大；
荧光：10-7～10 -9 s,第一激发单重态的最低振动能级→基态；
磷光：10-4～10s；第一激发三重态的最低振动能级→基态；
2021/3/9
授课：XXX
12
能级图
内转换
振动弛豫
内转换
S2
系间跨越
S1
能 量
吸 收
发
射
外转换
荧
光
T1 T2
产生色心而致色，常见的颜色有浅绿色至深绿色，蓝、绿蓝、黄、酒黄、
20紫21/3、/9 紫罗兰色、灰、褐、玫瑰红、深授红课：等XX。X
5
2001年美国遭受911袭击时，美国世贸大厦内一共 有2万5千多人，人们惊讶地发现了一个世界都为之惊 叹的纪录：两座大楼里，1万8千多人在上百层的大楼 完全断电的情况下，在一个半小时之内成功逃生。
S0→T1 禁阻跃迁； 通过其他途径进入
(见能级图)；进入的 几率小；
2021/3/9
授课：XXX
11
激发态→基态的能量传递途径
电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁 (发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；
传递途径
辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光 延迟荧光 磷光
系间跨越 内转移 外转移 振动弛豫
分子荧光和磷光光谱
2021/3/9
授课：XXX
1
内容(contents)
原理
分子荧光与磷光产生过程 激发光谱与荧光光谱 荧光的产生与分子结构关系 影响荧光强度的因素
仪器 应用
2021/3/9
授课：XXX
2
发光现象
起因
是吸收了外在提供的能量引起的
外在的能量
热 电 光 化学能
2021/3/9
授课：XXX
最大，相反跃
20迁21/3也/9 然。
授课：XXX
20
镜像规则
荧光激发光谱
荧光发射光谱
200
250
300
350 400
450
500
nm
蒽的激发光谱和荧光光谱
2021/3/9
授课：XXX
21
分子产生荧光的条件
分子产生荧光必须具备的条件
具有合适的结构（强的紫外可见吸收） 具有一定的荧光量子产率
荧光量子产率（）
外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。 系间跨越：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。
改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋—轨道耦合进行。
2021/3/9
授课：XXX
14
辐射能量传递过程
荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态
（ 多为 S1→ S0跃迁），发射波长为 l ‘2的荧光； 10-7～10 -
发
射
磷 光
振动弛豫
S0
l3
2021/3/9
l1
l2
l授2课：XXX
13
非辐射能量传递过程
振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级 至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12s。 内转换：同多重度电子能级中,等能级间的无辐射能级交换。
通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一 激发单重态的最低振动能级。 外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转 移能量的非辐射跃迁；
2021/3/9
授课：XXX
16
荧光（磷光）光谱
固定激发光波长(选最大 激发波长), 化合物发射 的荧光(或磷光强度)与 发射光波长关系曲线(图 中曲线II或III)。
2021/3/9
授课：XXX
17
光谱例子
荧光发射光谱 磷光光谱 荧光激发光谱
200 260 320 380 440 500 560 620
光照停止后，可持续一段时间。
2021/3/9
授课：XXX
15
激发光谱
荧光(磷光)：光致发光，照射光波长如何 选择？ 荧光(磷光)的激发光谱曲线
固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的 荧光(磷光)强度与照射光波长的关系曲线（图 中曲线I） 激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最 多，荧光强度最大；