UPLC_training

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Selecting Injection Wash Solvents ACQUITY UPLC™
Gradient Method：
— Weak needle wash solvent is initial mobile phase — Strong needle wash solvent is final mobile phase — Fine tuning may be required for specific samples
Technology
Cycle time
Sample Capacity
Needlewash Temperature control
samples Injection Range
UPLC
Loop based 30s or 11s with
load ahead 2 well plates
2 solvents Yes standard
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ACQUITY UPLCTM 开机操作
打开计算机电源,进入Windows操作系统 （如果有）打开Hub(网络集线器)电源 打开ACQUITY UPLC BSM和SM电源 先不要开TUV或PDA 电源
–光学检测器的电源需待流动池内充满液体后再打开 待各仪器设备通过自检后(绿灯长亮), 可以工作
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灌注SM注射器和进样针操作
从左边的目录中，选择Sample Manager,单击 Control > Prime syringes
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灌注SM注射器操作
出现Prime Syringes 对话框
Piercing Needle
Sample Needle
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Wash Syringes
Weak Wash Syringe
Strong Wash Syringe
Wash Syringe Drive Motor and Belt
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Sample Organizer
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ACQUITY UPLC系统启动
做样品分析之前ACQUITY UPLC系统的准备(SYSTEM START UP,系统启动) –打开 UPLC系统控制台,从主画面的下拉菜单选择所需的 START UP 功能.点击 START
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器具使用通则
总是使用清洁的玻璃器皿(瓶子, 量筒或溶剂过滤装置),并在用前冲洗干净 尽量保持一组溶剂瓶和玻璃器皿专用于ACQUITY UPLC 系统 决不要用其他实验室(例如微生物实验室等)的玻璃器具来冲洗你的玻璃容器 溶剂瓶要贴上注明流动相配制日期的标签 不要往系统上的流动相瓶中“添加”流动相 每24-48小时制备新鲜的水相流动相,尤其是100% 含水流动相 系统上的溶剂瓶要用合适的瓶盖盖好 不建议使用瓶装饮用水
Isocratic Method
— Weak can be the same or weaker — Strong can be the same or stronger
弱洗液：通常用90：10 = H2O：ACN 强洗液：通常用10： 90 = H2O：ACN
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选择 “ Sample syringe and wash syringes” 在Number of cycles中输入要作灌注的次数 (默认值为 1)
–(建议: 如果更换溶剂，建议做5次灌注) 单击 OK. 当系统状态是 “Idle(待机),” 就表示灌注做完了 提示: 每做一次灌注大约需要2－3分钟
BSM 湿灌注的步骤
选择 A1(或A2)、B1 (或B2) ，时间设定为3分钟， 按 start 按钮
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推荐的溶剂和 样品稀释剂
甲醇 超纯水 乙腈 异丙醇 乙醇 二甲基亚砜 N,N-二甲基甲酰胺
不推荐的溶剂和 样品稀释剂
二氯甲烷 氯仿 乙酸乙酯 氯化溶剂类(例如三氯苯) 甲苯 >5%的强酸
0.5- 50 uL
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Sample Manager Fluidics- Loop Based Injector
Fluidics Draw
Everflow Inject Valve
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Piercing and Sampling Needles
确认进样针和定量环体积 (Characterizing the needle and
sample loop volumes )
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色谱柱温箱
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色谱柱前在线过滤器
用于ACQUITY UPLC™ 色谱柱的 In-Line Filter (在线过滤器) 部件号P/N – 205000343
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Acquity BSM的准备(1)
灌注柱塞杆清洗液(Prime Seal wash) –以下情况需要做此操作Prime,例如: –新安装仪器或泵流路中溶液走干了 –当泵几小时或更长时间未用 –用过缓冲液流动相之后 –注意: –为避免螺线阀座和密封垫的损坏,不要使用非挥发性的缓冲液 –为避免污染,请勿循环使用Seal wash溶剂 –推荐: Seal wash溶剂中有机相比例不要超过10% –Seal wash前请检查溶剂是否足够
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ACQUITY UPLC的Biblioteka Baidu品瓶
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Waters玻璃样品瓶 –Type 1
所有Waters透明样品瓶是Type I : “33 号膨化玻璃” — 更少游离离子
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打开控制台界面
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Pump A
Pump B
SSV A
Plunger Wash
SSV B
Vent Valve
Tee Filter Mixer
Degasser
Column inlet
In-line filter unit
Flow Stabilizer tube assembly
Place wrenches here to connect In-line filter unit to Column inlet.
Place wrenches here to connect In-line filter unit to Stabilizer tube assembly.
不同进样方式的比较
重现性
满环 (Full Loop)
最好
部分环 针溢出(PLUNO)
重现性居中
部分环,压力辅助 (Partial Loop, pressure assist)
重现性最小
样品耗用 进样时间
环体积 x 溢出因 子(overfilles)
约50S
用户指定的进样体积 只是用户指定的进样
+ 15uL 的样品
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SM样品管理器的准备
做过BSM的wet prime之后，要准备样品管理器， 准备样品管理器包括如下步骤(新安装仪器时)：
–1.灌注(Priming Syringe)注射器 –2.确认进样针和定量环体积 (Characterizing the needle and sample loop volumes )
确认进样针和定量环体积(Characterizing the needle and sample loop volumes )
平时不用做，但更换弱洗溶剂和更换定量环后一定要做这一项
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与定量环体积相关的进样方式
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Prime Seal wash的步骤
选择 Control>Prime Sealwash,点击之
直至出口管有液体流出点击 可停止Prime过程
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Acquity BSM的准备(2)
湿灌注(Wet Priming)二元溶剂管理器 – 用于排除泵头及管路中的气泡 – 用于更换从储液瓶到溶剂管理器之间的溶剂 – Prime时的流速已设定为:A泵和B泵各4ml /min,总流速为8mL/min,无法改动
在下列情况下需要Prime二元溶剂管理器 –•启用新的二元溶剂管理器或新的系统 –•停机4小时后再次开机 –更换流动相
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BSM 湿灌注的步骤
在此界面下,选择 Control>Prime A/B Solvents.
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灌注SM注射器和进样针
灌注进样针和样品注射器的目的是: –冲洗里面的进样针、和进样口部分 –排除管路中的气泡 提示: – 确保用于灌注的溶剂有合适的组成,它应该是高纯的,并且几种溶剂是互溶的 –所有的试剂瓶都要使用滤头, 并确保溶剂体积足够用于做灌注 要求: 在检定密封之前必须先完成对样品管理器的灌注
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推荐使用的添加剂/改性剂
0.2% 甲酸 0.1% TEA 10mM 磷酸盐缓冲液 50mM 铵缓冲盐 0.1% EDTA 0.1% TFA 0.1% 六氟丁酸 10mM 碳酸氢铵 50mM 乙酸铵
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UPLC对洗针液的要求 –强洗针液用甲醇/水或乙腈/水(有机相的比例高于梯度洗脱的强溶剂的比例) –弱洗针液用纯水或含少量甲醇或乙腈的水溶液(有机相的比例低于梯度洗脱 的起始比例)
清洗柱塞密封垫(Seal Wash)的溶液 –超纯水含5%-10%甲醇
特别提示: 以上溶剂或溶液均需: –用0.22μm的膜过滤并脱气 –用洁净的玻璃容器盛放,避免污染
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样品制备
用以下方法的一种或几种组合制备样品 –固相提取 (例如 Oasis 或 Sep-Pak) –用 0.2um 滤膜过滤,例如：Acrodic 25mm Polypropylene housing male luer, 0.2um 200pcs/pkg (WAT097965) –沉淀蛋白 (例如 Sirocco) –液液萃取后用 0.2um 膜过滤 –离心 (高于8000rpm 离心20分钟并将上清液用0.2um 膜过滤转移至新样品瓶中)
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培训教程
(ACQUITY 系统操作)
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开机前的准备工作
UPLC对流动相的要求 –有机溶剂要求用色谱纯(进口名牌最好) –水或缓冲盐流动相要用超纯水(18.2MΩ), 当天制备
体积
约50S
最短，约25S
适用的进 100% 环体积 样体积
25-75% 环体积
25-50% 环体积
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更换定量环的注意事项
正确固定定量环并确保环的接头正确地插入六通阀的端口 在上紧压紧螺丝之前,确认没有产生死体积 每一个定量环接入六通阀的接口要专用(按第一次连接的位置连接) 正确选用与定量环大小相关的适用的进样方式（参见下表）