waters日常维护及操作

湿灌注 (Wet Prime)
1.将欲Wet Prime 的溶剂比例输入100% 2.按“Direct Function” 功能键，选择Wet Prime，按Enter。 Wet Prime 的设定值，一般为Flow : 5mL/min，Time: 2.0min，
然后按下“OK” 键，泵即开始进行Wet Prime 操作。（真空脱气机为
色谱泵及系统的钝化
钝化液用6M硝酸水溶液
6M硝酸的配制:取浓硝酸40ml与60ml水混匀
钝化步骤如下:
— 在清洗步骤完成后进行钝化处理 — 确认清洗用的磷酸已基本洗净
— 用纯水灌注泵头(四元泵的A,B,C,D四路各为25%)
— 用6M硝酸水溶液钝化系统(1ml/min流速)45分钟 — 换成清水洗至出口水pH显中性
仪器
*泵 *进样器 *检测器 *数据处理单元
HPLC系统压力问题分析
问题:系统压力高 可能的原因:
—温度太低 —流速太高 —流动相粘度大 —管路堵塞 —仪器或色谱柱堵塞 —压力传感器问题
HPLC系统压力问题分析
问题:压力低或没有压力 可能原因: —温度太高;流速太低 —泵关闭或保险丝断了 —泵未输送流动相 —系统内有渗漏处 —所用溶剂不正确 —自动进样器在Purge时卡住
非周期性噪声
气泡 - 流动相脱气
检测池内有气泡 - 流动相脱气, 检测池后加适当反压
系统有漏液之处 - 检漏并处理 溶剂混合不良 - 加装混合器 电噪声 - 去除噪声源
HPLC流路基线噪音问题分析
基线周期性波动
温度影响 - 环境温度及检测池温度控制. 注意空调的影响
溶剂混合不良 - 加装混合器
流动相脱气不良 - 流动相脱气
吸滤头
在线过滤器
单向阀
HPLC系统压力问题分析
单向阀的清洗如果使用过缓冲盐溶液请使用40 ℃
~50℃的温水超声20min 如果使用过纯乙腈请使用异丙醇超声20min 如果使用过其他流动相或上述两种溶液超声后请使用
纯甲醇超声20min
HPLC流路基线噪音问题分析
基线不稳定(不重复)
—检测池中有大的气泡 —流路中有小气泡流过 —系统未稳定或未达到化学平衡 —流动相被污染
— 用纯甲醇过渡，浸润泵头及管路，备用
紫外检测器
保持清洁，每天用后与色谱柱一起清洗；
使用脱过气的流动相，防止气泡滞留池内； 检测器灯有一定寿命，超过4小时不用时可以不开灯； 尽量避免使用pH>9.5的流动相，以防腐蚀流通池石英 窗，避免使用可能析晶的流动相，防止流通池堵塞。
HPLC常见故障分析
反压变化 - 溶剂和样品过滤. 注意黏度过大的样品
Байду номын сангаас
HPLC流路基线噪音问题分析
基线周期性噪声
绝大多数情况下是来源于泵的问题 泵头内有气泡 - 流动相脱气 ,泵头排气 泵进出口阀有问题 - 更换单向阀组件 柱塞杆有问题 - 更换柱塞杆及其密封圈 溶剂混合不良 - 加装混合器 电噪声 - 去除噪声源
HPLC流路基线噪音问题分析
干灌注和湿灌注
按主机上的“Menu/Status” 键，进入Status界面。检查真 空脱气机degasser的模式mode 是否为on。（一般为on）
当溶剂的管子是空的时候，或 不小心走干溶剂的时候执行干 灌注 (Dry Prime) 当需要排除气泡时，或平时更 换流动相时执行湿灌注 (Wet Prime) 。
废液管，按Halt。
4. 按Close。
密封圈清洗的溶液，在反相液相色谱中 可使用90％水/10％甲醇 (体积比，根据 实际需要进行选择)。
灌注针头清洗
1. 主界面中，选择Diag。 2. 按Prime Ndl Wash，缺省设定值 为30 秒，若想要多清洗几次时，
请按Start Again。
洗针溶液，在反相液相色谱中可使 用50％水/50％甲醇 (体积比，根据实 际需要进行选择)。
钝化的目的是使不锈钢管路的内表面形成光滑均匀的氧化膜
色谱泵及系统的清洗
清洗液用30%磷酸水溶液
30%磷酸配制:取85%浓磷酸35ml与65ml水混匀
清洗步骤如下:
— 取下色谱柱，用两通(Union)连接进样器和检测器 — 用纯水灌注泵头(四元泵的A,B,C,D四路各为25%) — 用30%磷酸清洗液洗系统(1ml/min流速)45分钟(四元泵的 A,B,C,D四路各为25%) — 换成清水洗至出口水pH显中性 — 用纯甲醇过渡，浸润泵头及管路，备用
加热

简单，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易造成流动相组 成的变化 同上，一般在溶剂抽滤的同时，也有脱气的效果 简单，但效果一般。超声时间不要太长(1分钟左右即可) 可保持连续脱气，多用于低压梯度 可保持连续脱气，多用于低压梯度
抽真空

超声波

通惰性气体（一般用氦气）

在线脱气机

流动相更换
用水更换色谱系统中缓冲液，将吸滤头部分放入 烧杯中边振动边清洗，并用水进行灌注，将管路 中的旧流动相替换，然后插入新的流动相中。
用新流动相更换水或冲洗色谱柱溶剂
更换流动相时，要保证两种溶剂的互溶性,如不互 溶，要用一种中间溶剂过渡（正反相系统变换时 一般用异丙醇过渡）
Waters溶剂瓶注意事项
源开关至 ON 的位置，仪器开 始进行自检。
2. 仪器将进行大约5分钟的自检过
程，待仪器自我测试完毕后，
画面上方的状态显示区会出现
“Idle” 状态，表示开机测试正 常。
色谱柱对流动相的要求
除去微粒 使用0.45μm或更细的膜过滤 酸碱性较强的流动相应注意对滤膜的腐蚀作用

纯度的要求 超纯水，梯度实验时水中有机杂质含量要低 缓冲液的pH值，在填料的允许范围内（一般为pH2-8） 缓冲液（盐）的浓度(≤100mM) 有机溶剂：色谱纯，并与填料相匹配 溶剂中的杂质含量
HPLC系统压力问题分析
问题:压力低或没有压力 可能原因:（续） —储液瓶中无溶剂 —低压限设置不当 —泵未正确排气 —溶剂入口过滤头堵 —入口管路中有空气 —泵失效
HPLC系统压力问题分析
问题:压力不稳 可能原因: —压力传感器问题 —泵排气不充分 —泵失效 —流动相未正确脱气 —所用溶剂不混溶或易挥发
色谱柱安装及连接的机械因素
连接适当
连接不妥，造成漏液
连接不妥
谱带展宽
色谱泵
色谱泵运行

注意∶


排气后，先设流速为 0 恢复排气时断开的部分，如∶进样器、色谱柱 根据色谱柱的不同，逐渐提高流速到设定值
色谱泵在停用时,应先用水洗去缓冲盐,然后用纯 甲醇充满泵头及管路,并保存在纯甲醇中
色谱泵
检查6根管子是否在液面下，必须确保6根管子全部
插到溶剂瓶的底部 溶剂瓶液面必须高于溶剂混合阀的位置；而洗针液
的溶剂瓶应放于试验台面上，与2695仪器底部位
于同一水平面上
灌注柱塞密封清洗
1. 主界面中，选择Diag。 2. 按Prime Seal Wash ，再按Start 3. 直到清洗溶剂流出泵杆密封圈冲洗
2.输入Sample Loop 体积清洗的倍数(原定值为6 倍)，按Enter。
冲洗进样器
每次进样前仪器会洗针（Needles wash）进样之
后不洗针 进样针是流路的组成部分,运行中一直由流动相清洗 每次批量进完样后手动清洗
或最后进一针50μl流动相
如果流动相中有盐的话则用水替代缓冲盐那部分比例
Waters2695-2489 HPLC系统
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HPLC日常维护 及实验操作
开机及准备系统
开机自检 管路是否已干 是 执行干灌注
准备流动相
否 灌注柱塞密封 清洗 灌注针头清洗
执行湿灌注
冲洗进样器
设定流动相平 衡色谱柱 放入样品盘
检查真空脱气 机状态
开机自检
1. 打开Alliance 2695和2489 的电
液相色谱对样品(包括标样)制备的要求
— 必须能溶于流动相
如样品的溶剂不是流动相,一定要用流动相试溶解度,以免在 进样时样品在流动相中析出,堵塞管路和色谱柱
— 样品溶液要过滤除去微粒及杂质 — 了解样品对色谱柱的基质/填料是否有破坏作用
样品预处理常用的方法
高速离心取上清液 过滤、超滤 选择性沉淀 衍生反应 液-液萃取 固相提取(Solid Phase Extract,SPE ) — Oasis和Sep-Pak固相提取小柱 其它
能引起HPLC发生问题的潜在因素:
工作环境 流动相 进样器 在线过滤器 色谱柱 数据处理装置 电源及地线 泵 保护柱 连接管路 检测器 操作
逻辑判断及处理
问题
化学品
*色谱柱/保护柱 *流动相 *样品
环境
*电源 *地线 *温度 *湿度 *清洁程度
从最简单,容易之处入手: 如 1.停止流速; 2.去掉柱子;
—检测器流动池漏
—色谱柱污染
HPLC流路基线噪音问题分析
基线漂移
色谱柱有其他组份被洗脱出 - 冲洗, 直至基线稳定
溶剂发生变化 (如溶入气体或溶剂挥发) - 氦气或脱气机脱气, 溶剂瓶避光,密封(但要注意防止溶剂瓶内产生负压)
系统有漏液之处 - 检漏并处理
环境温度影响 (尤其对示差,电导,电化学检测) - 室温,柱温,检 测池温度控制 环境湿度影响 对光检测器有较大影响
使用HPLC级试剂,注意泵压力不要太高,要适当 调整压力,一般压力上限在3500-4000Psi 注意防止因泵堵塞造成压力过高损坏柱塞杆或烧 坏电机。
液相色谱系统的清洗与钝化
色谱泵吸滤头,进出口阀及管路(包括进样器和检测池)若被污染, 应作清洗和钝化处理 一般采用30％磷酸水溶液作为清洗剂，用6M硝酸作为钝化剂 先清洗再钝化 清洗的目的是去除不锈钢管路及系统内的污垢
2 星期
1 星期 1天 1 小时 新鲜配制 0 5 10 15 20 25
保存于标准棕色玻璃瓶中的超纯水
测试条件 水样: 40ml trace enrichment @ 2.0 ml/min 色谱柱: C18 反相柱 (Waters) 梯度: 线性 100% 水－ 100% 乙腈 波长: 254 nm
1星期
1天
新鲜配制
0
5
10 分
15
20
25
流动相的脱气目的
— 使色谱泵的输液准确
o 输液量均匀准确，并且脉动减小 o 保留时间及色谱峰面积的重现性提高
— 提高检测的性能
o 防止气泡引起的尖峰 o 基线稳定，信噪比增加 o 溶剂的紫外吸收本底降低
— 保护色谱柱
o 减少死体积 o 防止填料的氧化
流动相脱气的方法
干灌注 (Dry Prime)
1.将空的针筒插入抽液阀（排液阀）中，打开抽液阀(以逆时针的方向将 抽液阀旋2-3圈)。 2.按“Menu/Status” 键，进入Status (1)画面，按“Direct Function” 功能 键，选择Dry Prime，按Enter。 3.按下欲使用的溶剂开启阀门(例如:Open A)，然后将针筒向外拉，抽出 约5~10mL溶剂并完全抽出溶剂管子内的气泡，完成后关闭排液阀。排液 阀不要拧太紧，以不漏液为准。
在线状态时，流速不要超过5ml/min） 3. 重复上述的步骤直到对所有溶剂的Wet Prime执行完毕。
注意事项：若有缓冲盐流动相,灌注前用后均需用水过渡
冲洗进样器 (Purge Injector)
何时执行？
○ 改变溶剂时。
○ 发现注射器及其管路内有气泡时。
○ 每天开机和关机的时候。
1.按“Direct Function” 键，选择Purge Injector，按Enter。
避免用含卤素离子的缓冲液（如：碘化锂、氯化 钾等） 选用适宜的容器 —玻璃容器必须使用超纯水清洗
保存于聚乙烯瓶中的超纯水
测试条件 水样: 40ml trace enrichment @ 2.0 ml/min 色谱柱: C18 反相柱 (Waters) 梯度: 线性 100% 水－ 100% 乙腈 波长: 254 nm
供电电源的影响
泵不良 – 检修泵
HPLC流路基线噪音问题分析
基线有无规律的尖峰
气泡 - 溶剂脱气 电路接触不良 - 保证清洁, 接线牢固, 接点无氧化 光源灯不良- 检查处理 电噪声 - 去除噪声源
液相色谱对流动相的要求
必须用色谱纯有机溶剂 — 室温下密封,避光保存 水或缓冲盐溶液要用超纯水(18.2MΩ) 缓冲盐流动相: — 当日现配现用 — 低温下密封保存,一般不超过3天 — 最好加5%有机溶剂混合保存
液相色谱对流动相的要求
有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相: — 低温密封保存 — 防止有机相的挥发