靶向沉默p65基因对人乳腺癌细胞MDA MB 231增殖及凋亡的影响
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Effect of microRNA-mediated p65 gene silencing on the proliferation and apoptosis of human breast cancer MDA-MB-231 cells
WANG Ling, SANG Mei-xiang, LIAN Yi-shui, WANG Bin, DING Chun-yan, SHAN Bao-en Department of Immunology, Tumor Research Institute, Fourth Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050011, China
p65miRNA-3-R CCTGATCCGGTGACGCGTCTGTAGTCAGTCAGTGGCCAAAACTACAGACGATCGTCACCGGATC
1.4 真核表达质粒p65miRNA转染MDA-MB-231细胞 件：94℃预变性 5 min，94 ℃变性 50 s，60 ℃退火 50 s，
转染前将MDA-MB-231细胞以2×105个/孔的密度 72 ℃延伸40 s，35个循环。72 ℃ 5 min，4 ℃终止。最后
根据人 p65 基因序列[NM_021975]转录 RNA 的作 用位置，设计 3 对长度为 21nt 的序列（表 1），设计时已经 经 BLAST 进行同源性比较分析，所设计的靶 mRNA 与 人类细胞内任何基因没有同源性。在连接酶作用下与 线性表达质粒 pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR 合成环 形的重组质粒。构建了 3 个针对靶位点的质粒表达载 体，即 pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-p65-1（简称为 p65miRNA-1）、pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-p65-2 （简 称 为 p65miRNA-2）、pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR-p65-3（简 称 为 p65miRNA-3）和 阴 性 对 照 载 体 pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-Negtive（简称为 NegmiRNA）。
网络出版时间：2011-10-4 12:23 网络出版地址：/kcms/detail/44.1627.r.20111004.1223.016.html
·论著·
靶向沉默 p65 基因对人乳腺癌细胞 MDA-MB-231 增殖及凋亡的 影响
王 玲，桑梅香，连易水，王 彬，丁春艳，单保恩 河北医科大学第四医院肿瘤研究所免疫室，河北 石家庄 050011
用含 10%胎牛血清、青霉素（100 U/ml）、链霉素 （100 μg/ml）的DMEM完全培养基，在37 ℃、5% CO2饱
和湿度条件下进行培养。倒置显微镜下观察细胞生长 状态，细胞生长呈 70%~80%融合状态时，以 0.25%胰蛋 白酶消化传代，隔日换液，每3~4 d传代一次。收集对数 生长期细胞进行实验。 1.3 p65miRNA质粒表达载体的设计、合成
液(含 2 μg 待转质粒和 1 μl LipofectamineTM2000)，培养 度值。
收稿日期：2011-06-19 基金项目：河北省科学技术研究与发展计划项目（10276167） 作者简介：王 玲，博士，主治医师，E-mail: wangling1981@ 通讯作者：单保恩，博士，教授，E-mail: shanbaoen@
差、且伴有淋巴结转移的浸润性导管癌中 NF-κB 活性更 高［3-4］。因此，有学者推测，NF-κB 组成性活化可能是雌 激素受体阴性乳腺癌重要的发病机制之一。 MDA-MB-231 细胞株是一种高侵袭性，雌、孕激素受体 均为阴性的乳腺癌细胞。我们前期的研究发现， MDA-MB-231 细胞中 NF-κB 异常激活，并且 NF-κB 的 p65 亚基与该细胞的生物学活性密切相关。因此，本实 验我们重点研究靶向沉默 p65 基因观察其对细胞增殖 及凋亡的影响。
p65miRNA-1-R CCTGCATGGTGGGAATCATCATAGTCAGTCAGTGGCCAAAACTATGATGAGTTTCCCACCATGC
p65miRNA-2-F TGCGTTCATCTCCTGAAAGGAGGCCGTTTTGGCCACTGACTGACGGCCTCCTCAGGAGATGAA
乳腺癌是女性常见的一种高度异质性的恶性肿 瘤。十年间我国主要城市的乳腺癌发病率增长了 37%。特别是在 30~54 岁年龄组中，乳腺癌已成为威胁 女性健康的“头号杀手”［1-2］。目前，大量的研究资料显 示，NF-κB 信号通路的异常活化与乳腺肿瘤关系十分密 切。Biswas 等报道，雌激素受体阴性乳腺癌中，NF-κB 活性显著高于雌激素受体阳性乳腺癌，尤其在组织分化
摘要：目的 利用 miRNA（microRNA, miRNA）靶向沉默 p65 基因，观察其对人乳腺癌细胞 MDA-MB-231 增殖及凋亡的影 响。方法 以脂质体 LipofectamineTM2000 为载体，将针对特异靶点 p65 基因的 miRNA 转染入 MDA-MB-231 细胞。 RT-PCR 和 western blot 法检测 p65 mRNA 和蛋白表达的变化；MTT 法检测细胞增殖；流式细胞技术（flow cytometry, FCM）检测细胞凋亡；western blot 法检测凋亡相关因子表达的变化。结果 RT-PCR 和 western blot 检测结果显示， p65miRNA转染组p65 mRNA及蛋白表达量较对照组显著下降（P<0.05）；MTT检测结果显示，沉默p65基因后，细胞出现 了生长抑制现象；FCM 检测结果发现，p65miRNA 转染组细胞凋亡率显著增加（P<0.05）。Western blot 进一步检测发现， 转染组细胞中 caspase-3 的前体蛋白条带变细，裂解片段条带加深；PARP 蛋白出现裂解片段。结论 miRNA 靶向沉默 p65 基因可抑制人乳腺癌细胞增殖，促进细胞凋亡。推测 p65 基因可能成为乳腺癌基因治疗的一个新靶点。 关键词：乳腺癌；基因沉默；miRNA；细胞增殖；细胞凋亡；p65 中图分类号：R735.35 文献标志码：A 文章编号：1673-4254（2011）10
接种于 24 孔板，置于 37 ℃、5% CO2的培养箱中培养 取扩增产物10 μl在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，产物条带
24 h，然后吸尽上清液，用Opti-MEM®I无血清培养基将 用凝胶成像ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ统照相并进行灰度分析。目的片段的相
24 孔板中的细胞漂洗 2 次。实验组加入 l ml 转染混合 对表达量计算公式为：目的基因的灰度值/β-actin 的灰
Abstract: Objective To explore the effect of microRNA (miRNA)-mediated p65 gene knockdown on the proliferation and apoptosis of human breast cancer MDA-MB-231 cells. Methods p65-targeted miRNA plasmid was constructed and transfected into MDA-MB-231 cells via lipofectamineTM2000. The expression of p65 gene in the transfected cells at the mRNA and protein levels were detected by RT-PCR and Western blotting, respectively. The cell proliferation and apoptosis were measured by MTT assay and flow cytometry (FCM), respectively. The expressions of apoptosis-related proteins were detected by Western blotting in the transfected cells. Results Compared with the negative control group, the expressions of p65 mRNA and protein in p65miRNA-trasnfected cells were significantly downregulated (P< 0.05). MTT assay showed significantly lowered viability of MDA-MB-231 cells after the transfection (P<0.05)． FCM showed an increased cell apoptosis rate in p65miRNA group compared with that in the negative control group (P< 0.05)． Caspase-3 and PARP were both cleaved into their active forms and the expression of these active forms was increased in p65miRNA group. Conclusion The miRNA targeting p65 gene can inhibit the proliferation and induce apoptosis of breast cancer cells, and p65 gene might become a new target in gene therapy for human breast cancer． Key words: breast cancer; gene interference; microRNA; cell proliferation; apoptosis; p65
表 1 针对 p65 基因设计的 p65miRNA 寡核苷酸序列
Tab.1 Oligonucleotides sequence of p65-targeted miRNA
Gene
Sequence of miRNA
p65miRNA-1-F TGCTGCATGGTGGGAAACTCATCATAGTTTTGGCCACTGACTGACTATGATGATTCCCACCATG
1 材料和方法
1.1 材料 人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞株购自中国科学院
细胞库上海保藏中心。胎牛血清购自杭州四季青公 司。高糖型 DMEM 培养基购自 Gibco 公司。胰蛋白 酶、四甲基偶氮唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）、磷酸 盐缓冲液（PBS）购自 Sigma 公司。TRIzol 试剂、脂质体 LipofectamineTM2000、Opti-MEM®I 无血清培养基购自 美 国 Invitrogen 公 司 。 M-MLV 反 转 录 试 剂 盒 购 自 Fermentas 公司，引物及探针合成由上海生物工程技术 服务有限公司提供。核蛋白抽提及定量试剂盒购自美 国 Pierce 公司。兔抗人 p65、GAPDH 多克隆抗体，小鼠 抗人 PARP、caspase-3 单克隆抗体购自美国 Santa Cruz 公司。ECL 化学发光试剂盒购自北京中杉生物有限公 司。 1.2 细胞培养
p65miRNA-2-R CCTGTTCATCTCCTGAGGAGGCCGTCAGTCAGTGGCCAAAACGGCCTCCTTTCAGGAGATGAAC
p65miRNA-3-F TGCTGATCCGGTGACGATCGTCTGTAGTTTTGGCCACTGACTGACTACAGACGCGTCACCGGAT
WANG Ling, SANG Mei-xiang, LIAN Yi-shui, WANG Bin, DING Chun-yan, SHAN Bao-en Department of Immunology, Tumor Research Institute, Fourth Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050011, China
p65miRNA-3-R CCTGATCCGGTGACGCGTCTGTAGTCAGTCAGTGGCCAAAACTACAGACGATCGTCACCGGATC
1.4 真核表达质粒p65miRNA转染MDA-MB-231细胞 件：94℃预变性 5 min，94 ℃变性 50 s，60 ℃退火 50 s，
转染前将MDA-MB-231细胞以2×105个/孔的密度 72 ℃延伸40 s，35个循环。72 ℃ 5 min，4 ℃终止。最后
根据人 p65 基因序列[NM_021975]转录 RNA 的作 用位置，设计 3 对长度为 21nt 的序列（表 1），设计时已经 经 BLAST 进行同源性比较分析，所设计的靶 mRNA 与 人类细胞内任何基因没有同源性。在连接酶作用下与 线性表达质粒 pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR 合成环 形的重组质粒。构建了 3 个针对靶位点的质粒表达载 体，即 pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-p65-1（简称为 p65miRNA-1）、pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-p65-2 （简 称 为 p65miRNA-2）、pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR-p65-3（简 称 为 p65miRNA-3）和 阴 性 对 照 载 体 pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-Negtive（简称为 NegmiRNA）。
网络出版时间：2011-10-4 12:23 网络出版地址：/kcms/detail/44.1627.r.20111004.1223.016.html
·论著·
靶向沉默 p65 基因对人乳腺癌细胞 MDA-MB-231 增殖及凋亡的 影响
王 玲，桑梅香，连易水，王 彬，丁春艳，单保恩 河北医科大学第四医院肿瘤研究所免疫室，河北 石家庄 050011
用含 10%胎牛血清、青霉素（100 U/ml）、链霉素 （100 μg/ml）的DMEM完全培养基，在37 ℃、5% CO2饱
和湿度条件下进行培养。倒置显微镜下观察细胞生长 状态，细胞生长呈 70%~80%融合状态时，以 0.25%胰蛋 白酶消化传代，隔日换液，每3~4 d传代一次。收集对数 生长期细胞进行实验。 1.3 p65miRNA质粒表达载体的设计、合成
液(含 2 μg 待转质粒和 1 μl LipofectamineTM2000)，培养 度值。
收稿日期：2011-06-19 基金项目：河北省科学技术研究与发展计划项目（10276167） 作者简介：王 玲，博士，主治医师，E-mail: wangling1981@ 通讯作者：单保恩，博士，教授，E-mail: shanbaoen@
差、且伴有淋巴结转移的浸润性导管癌中 NF-κB 活性更 高［3-4］。因此，有学者推测，NF-κB 组成性活化可能是雌 激素受体阴性乳腺癌重要的发病机制之一。 MDA-MB-231 细胞株是一种高侵袭性，雌、孕激素受体 均为阴性的乳腺癌细胞。我们前期的研究发现， MDA-MB-231 细胞中 NF-κB 异常激活，并且 NF-κB 的 p65 亚基与该细胞的生物学活性密切相关。因此，本实 验我们重点研究靶向沉默 p65 基因观察其对细胞增殖 及凋亡的影响。
p65miRNA-1-R CCTGCATGGTGGGAATCATCATAGTCAGTCAGTGGCCAAAACTATGATGAGTTTCCCACCATGC
p65miRNA-2-F TGCGTTCATCTCCTGAAAGGAGGCCGTTTTGGCCACTGACTGACGGCCTCCTCAGGAGATGAA
乳腺癌是女性常见的一种高度异质性的恶性肿 瘤。十年间我国主要城市的乳腺癌发病率增长了 37%。特别是在 30~54 岁年龄组中，乳腺癌已成为威胁 女性健康的“头号杀手”［1-2］。目前，大量的研究资料显 示，NF-κB 信号通路的异常活化与乳腺肿瘤关系十分密 切。Biswas 等报道，雌激素受体阴性乳腺癌中，NF-κB 活性显著高于雌激素受体阳性乳腺癌，尤其在组织分化
摘要：目的 利用 miRNA（microRNA, miRNA）靶向沉默 p65 基因，观察其对人乳腺癌细胞 MDA-MB-231 增殖及凋亡的影 响。方法 以脂质体 LipofectamineTM2000 为载体，将针对特异靶点 p65 基因的 miRNA 转染入 MDA-MB-231 细胞。 RT-PCR 和 western blot 法检测 p65 mRNA 和蛋白表达的变化；MTT 法检测细胞增殖；流式细胞技术（flow cytometry, FCM）检测细胞凋亡；western blot 法检测凋亡相关因子表达的变化。结果 RT-PCR 和 western blot 检测结果显示， p65miRNA转染组p65 mRNA及蛋白表达量较对照组显著下降（P<0.05）；MTT检测结果显示，沉默p65基因后，细胞出现 了生长抑制现象；FCM 检测结果发现，p65miRNA 转染组细胞凋亡率显著增加（P<0.05）。Western blot 进一步检测发现， 转染组细胞中 caspase-3 的前体蛋白条带变细，裂解片段条带加深；PARP 蛋白出现裂解片段。结论 miRNA 靶向沉默 p65 基因可抑制人乳腺癌细胞增殖，促进细胞凋亡。推测 p65 基因可能成为乳腺癌基因治疗的一个新靶点。 关键词：乳腺癌；基因沉默；miRNA；细胞增殖；细胞凋亡；p65 中图分类号：R735.35 文献标志码：A 文章编号：1673-4254（2011）10
接种于 24 孔板，置于 37 ℃、5% CO2的培养箱中培养 取扩增产物10 μl在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，产物条带
24 h，然后吸尽上清液，用Opti-MEM®I无血清培养基将 用凝胶成像ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ统照相并进行灰度分析。目的片段的相
24 孔板中的细胞漂洗 2 次。实验组加入 l ml 转染混合 对表达量计算公式为：目的基因的灰度值/β-actin 的灰
Abstract: Objective To explore the effect of microRNA (miRNA)-mediated p65 gene knockdown on the proliferation and apoptosis of human breast cancer MDA-MB-231 cells. Methods p65-targeted miRNA plasmid was constructed and transfected into MDA-MB-231 cells via lipofectamineTM2000. The expression of p65 gene in the transfected cells at the mRNA and protein levels were detected by RT-PCR and Western blotting, respectively. The cell proliferation and apoptosis were measured by MTT assay and flow cytometry (FCM), respectively. The expressions of apoptosis-related proteins were detected by Western blotting in the transfected cells. Results Compared with the negative control group, the expressions of p65 mRNA and protein in p65miRNA-trasnfected cells were significantly downregulated (P< 0.05). MTT assay showed significantly lowered viability of MDA-MB-231 cells after the transfection (P<0.05)． FCM showed an increased cell apoptosis rate in p65miRNA group compared with that in the negative control group (P< 0.05)． Caspase-3 and PARP were both cleaved into their active forms and the expression of these active forms was increased in p65miRNA group. Conclusion The miRNA targeting p65 gene can inhibit the proliferation and induce apoptosis of breast cancer cells, and p65 gene might become a new target in gene therapy for human breast cancer． Key words: breast cancer; gene interference; microRNA; cell proliferation; apoptosis; p65
表 1 针对 p65 基因设计的 p65miRNA 寡核苷酸序列
Tab.1 Oligonucleotides sequence of p65-targeted miRNA
Gene
Sequence of miRNA
p65miRNA-1-F TGCTGCATGGTGGGAAACTCATCATAGTTTTGGCCACTGACTGACTATGATGATTCCCACCATG
1 材料和方法
1.1 材料 人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞株购自中国科学院
细胞库上海保藏中心。胎牛血清购自杭州四季青公 司。高糖型 DMEM 培养基购自 Gibco 公司。胰蛋白 酶、四甲基偶氮唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）、磷酸 盐缓冲液（PBS）购自 Sigma 公司。TRIzol 试剂、脂质体 LipofectamineTM2000、Opti-MEM®I 无血清培养基购自 美 国 Invitrogen 公 司 。 M-MLV 反 转 录 试 剂 盒 购 自 Fermentas 公司，引物及探针合成由上海生物工程技术 服务有限公司提供。核蛋白抽提及定量试剂盒购自美 国 Pierce 公司。兔抗人 p65、GAPDH 多克隆抗体，小鼠 抗人 PARP、caspase-3 单克隆抗体购自美国 Santa Cruz 公司。ECL 化学发光试剂盒购自北京中杉生物有限公 司。 1.2 细胞培养
p65miRNA-2-R CCTGTTCATCTCCTGAGGAGGCCGTCAGTCAGTGGCCAAAACGGCCTCCTTTCAGGAGATGAAC
p65miRNA-3-F TGCTGATCCGGTGACGATCGTCTGTAGTTTTGGCCACTGACTGACTACAGACGCGTCACCGGAT