【2019年整理】使用微载体在生物反应器中制备Vero细胞狂犬病疫苗的试验(1)

使用微载体在生物反响器中制备Vero 细胞狂犬病疫苗的试验
一、资料
1、微载体
GE 企业 Cytodex 1 ，25g
2、生物反响器
上海日泰企业 Cellipower 5L，工作体积 3.5L
加微载体 25g（约 7g/L ）
3、细胞、毒种、培育液
二、操作过程
1、微载体办理、反响罐准备
取微载体 25g 用 PBS溶液清洗几次后室温下浸泡膨胀留宿。

弃去上清液，将载
体转移到 2L 瓶内加入 PBS约 1L，灭菌后备用。

将微载体装到生物反响罐内，换上新的PBS溶液4L，安装好生物反响罐灭菌（126℃*80min ）。

2、生物反响器校订、调试
反响罐灭菌前调试生物反响器，保证能正常运转，各参数正常。

用 pH 为 7.0/10.0
的标准缓冲液校订 pH电极 2 次。

灭菌后，温度 37℃校订 DO电极。

3、预培育
DO 电极校订完后，封闭进气，停止搅拌，过15 分钟待载体沉降后排空上清液，加
入 199 培育液 3 L 浸泡办理载体，浸泡 3 小时后相同封闭进气停止搅拌 15 分钟后排空上
清液，加入 7.5%重生牛血清培育液 3L ，设置温度 37℃、 pH7.2、DO 50、搅拌转
速 60RPM，预培育留宿，留神反响器运转能否正常，各参数能否稳固能调控。

4、接种细胞
接种细胞当日先排空反响罐内预培育的 7.5%重生牛血清培育液，从头加入 7.5% 重生
牛血清培育液 3L ，设置温度 37℃、 pH7.2、DO50、搅拌转速 60RPM。

待温度稳固在 37℃后取样校订 pH 值，而后准备接种细胞。

封闭温度、 pH、DO 控制，封闭进气，搅拌转速设为 30RPM，将适当细胞悬液慢慢
加入反响罐内，接种细胞总数为 1.8*10 9个（密度约 5*105个/ml ），温度慢慢调回 37℃，接种细胞后 2 小时开始进气，开启 pH、DO 控制，设置温度 37℃、 pH7.2、DO50、搅拌
转速 30RPM。

搅拌转速在接种细胞 4 小时后设为 40RPM、5 小时后设为 50RPM、6 小时
后设为 60RPM，开始进入细胞培育阶段。

批号定为 W20120601
5、细胞培育
设置温度 37℃、 pH7.2、DO50、搅拌转速 60RPM并保持稳固，进行细胞培育。

每日取样一次（ 2 管）检测葡萄糖含量、进行显微镜察看。

适合调整灌输量，保持葡萄
糖含量大于 1g/L 。

6、接种病毒
细胞培育4 天已长满，进行病毒接种。

封闭进气，停止搅拌，过10 分钟待载体沉降
后排空上清液，加入 1%重生牛血清培育液 3L，10 分钟后排空上清液，再加入 1% 重生
牛血清培育液 3L ，设置温度 35℃、 pH7.4、DO50、搅拌转速 50RPM，待各参数稳固后
取样校订 pH值。

封闭温度、 pH、DO 控制，封闭进气，搅拌转速设为 30RPM，
而后将 50ml 毒种接种入反响罐内。

温度慢慢调回 35℃，接种病毒后 30 分钟开始进气，
开启pH、DO 控制，设置温度35℃、pH7.4、DO50、搅拌转速30RPM。

搅拌转速在接
种病毒 3 小时后设为 40RPM、5 小时后设为 50RPM。

接种病毒 6 小时后开始灌输 1%重
生牛血清培育液 7L/ 天。

开灌输前取样。

7、洗换
接毒次日先取样，再洗换 5 次，每次加入 199 培育液 4L，静置 10 分钟后排空上清液，洗换完加入 0.1%人血白蛋白培育液 3.5L ，设置温度 35℃、 pH7.4、DO 50、搅拌转速
30RPM。

洗换后 30 分钟开始进气，开启 pH、DO 控制，设置温度 35℃、pH7.4、 DO 50、搅拌转速 30RPM。

搅拌转速在洗换 3 小时后设为 40RPM、5 小时后设为 50RPM。

洗换 6
小时后开始灌输 0.1%人血白蛋白培育液 7L/ 天，开始病毒液收获。

8、病毒液收获
灌输 0.1%人血白蛋白培育液7L/ 天（收获 3 天后改为 5L/ 天），收获病毒液。

收获
时每日取样，测抗原并进行显微镜察看。

每两、三天的收获液收到一个 50L 桶内，每桶取
样测抗原、 DNA 、 HCP、毒力等。

依据抗原检测结果确立收获天数。

9、下罐
培育结束后下罐，用 1.0mol/L NaOH 溶液办理反响罐及微载体 2 小时，再将反响罐、硅胶管等拆掉冲洗洁净后烘干备用。

三、细胞培育状况
日期事项残糖 g/L灌输量 L耗糖量 g其余
6-13接种细胞
6-14培育 1天 3.130 3.74
6-15培育 2天 2.560.7 2.98变酸，关 CO开进碱
2
6-16培育 3天 2.12 2.5 6.19
6-17培育 4 天，接毒 2.7 6.5 5.43清晨变碱，开 CO2关进碱
四、病毒培育及收获液检测结果
1、病毒培育状况
日期事项灌输量 L病毒收获液其余
6-17洗换7
6-18收获 1天7
6-19收获 2天7
6-20收获 3天7W20120601①， 14L
6-21收获 4天5
6-22收获 5天5W20120601②， 12L
6-23收获 6天5
6-24收获 7天5
6-25收获 8天5W20120601③， 15L
6-26收获 9 天下罐5W20120601④， 10L
2、收获液检测结果
批号G抗原PCR(100pg/ml)HCP.天坛HCP.Cyg 残留牛
毒力血清
W20120601接
-毒 1d0.0449 1.54 4.06
W20120601收
-毒 1d0.021481 1.65 6.44
W20120601收
-毒 2d0.239148 2.5810.93
W20120601收
-毒 3d0.712260716.13
W20120601收
-毒 4d 1.4077886
W20120601收
-毒 5d0.6540071 3.2814.37
W20120601收
-毒 6d0.7342266
W20120601收
-毒 7d0.38
W20120601收
-毒 8d0.3270536 4.6117.03
W20120601①0.13610 1.59 1.86＞897
W20120601②0.482282 1.99 5.73＞219待测W20120601③0.541341 2.912.02＞115待测W20120601④0.427029 4.4511.51未测待测
五、存在问题
1、第一次试验，载体密度偏低，下次可装约12～15g/L
2、接种细胞密度过高，
3、4天就长满，下次可降低至1*10 5～2*10 5个/ml （总数
3.5*10 8～７ *10 8个）
3、对微载体培育反响器操作不够娴熟，排液时微载体附着并向来粘结在出液管筛
网上，停止搅拌沉降载体后有部分载体凝固在罐底处等
4、收获液残留牛血清偏高多倍，原由是洗换时为了不带出微载体，致使留在罐内
的液体偏多，下次可将排液管安装低一点，或改进排液方式。