免疫组化各步原理

一、免疫组化技术免疫组织化学（Immunohistochemistry"HC）技术是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测技术。

目前，这种技术在临床病理诊断和形态学研究中已得到广泛应用。

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（一）、免疫组化常用染色方法和步骤（石蜡切片）
SP法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法）:
SP法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法）原理采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及底物色素混合液来测定细胞和组织中的抗原。

主要步骤:
主要步骤1、石蜡切片脱蜡（与常规HE切片脱蜡相同）：石蜡切片置60 ℃ 烤箱烤片15小时以上一从烤箱中拿出立即放入二甲苯I中5~10 min一二甲苯II 5~10min 一无水乙醇5min 一95%乙醇5min 一80%乙醇5min 一70%乙醇5min 一自来水洗
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2、3%H2O2阻断20min （以消除内源性过氧化物酶的活性，降低背景）；PBS 洗3次，每次5min。

3、抗原修复；PBS洗3次，每次5min。

4、滴加5~10% 正常山羊血清封闭，37℃, 10min （消除背景非特异性着色）
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5、吸干组织周围多余的血清，不洗，滴加第一抗体，37℃,孵育60min或孵育30min 再4℃冰箱过夜；PBS洗3次，每次5min。

6、擦干组织周围PBS, 滴加生物素标记的第二抗体，37c 孵育20min, PBS洗3次，每次5min。

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7、擦干组织周围PBS,滴加链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液37c 孵育20min。

8、PBS洗3次，每次5min, D.W洗2次，DAB显色（DAB必须现用现配），镜下控制显色程度，自来水冲洗，苏木素复染胞核，烤干，中性树胶封片。

染色步骤:
染色步骤石蜡切片脱蜡到水；3%H2O2阻断10min （以消除内源性过氧化物
酶的活性，降低背景）；蒸馏水洗2次，PBS洗3次，每次5min。

抗原修复；PBS洗3次，每次5min；
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滴加第一抗体，37℃孵育60min或37℃孵育30min再4℃冰箱过夜；PBS洗3 次，每次3min。

擦干组织周围PBS,滴加酶标抗鼠/兔聚合物,37℃,孵育
20min。

PBS洗3次，每次3min, D.W洗2次，DAB显色，镜下控制，自来水充分冲洗，复染，烤干，中性树胶封片。

（四）抗原修复:
（四）抗原修复目的：1、甲醛固定过程中形成醛键而封闭部分抗原决定簇；
2、甲醛在保存过程中会形成羧甲基而封闭部分抗原决簇；
3、固定剂固定组织时，会使组织中蛋白与蛋白之间发生交联，也可能封闭抗原决定簇。

4、抗原决定簇被封闭之后,会影响抗原抗体的结合,因此在染色时需先
进行抗原修复，通过抗原修复，充分暴露抗原决定簇。

使抗原抗体得以充分结合。

抗原修复的作用机理是1、抗原修复液中的化学物质分子或离子与部分抗原决定族结合产生化学反应，增加了细胞和组织的通透性，便于抗原抗体的充分结合。

2、高温可以使某些已封闭的抗原决定族得以重新暴露和修复。

3、微波是一种高频电磁波，可打开蛋白质之间的交联键，从而使抗原修复。

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抗原修复注意事项:
抗原修复注意事项1、应根据不同的抗原选择合适的修复方法。

2、热处理后
应注意自然冷却，酶消化后要洗干净。

3、防止切片干燥，特别是热修复时要防止修复液蒸发而使切片干燥。

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4、注意形态学结构的改变和脱片问题：酶消化浓度过高，时间过长、温度过高都可能导致组织的形态结构改变；热修复时间过长也可能导致形态学结构改变和脱片。

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（五）常用溶液的配制1、0.01MPBS:磷酸二氢钠（NaH2PO4） 1.5g磷酸氢二钠（Na2HP0412H2O） 14.5g氯化钠42.5g氢氧化钠2粒加蒸馏水5000ml Slide 24:
2、3%H2O2 甲醇450ml 30%H2O2 50ml 混匀。

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3、pH值6. 0的柠檬酸缓冲液3.1储存液：A液：枸橼酸21.01g蒸馏水
1000ml B液：枸橼酸钠29.41g蒸馏水1000ml
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0.1 3.2工作液：A液9ml B液41ml蒸馏水450ml溶液pH值为6.0
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4、胰蛋白酶（0.05%~0.1% ）取0.05g或0.1g胰蛋白酶加入到100ml 0.1% pH7.8 的无水氯化钙水溶液中溶解即可。

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5、胃蛋白酶（0.4%）胃蛋白酶0.4克0.1mol/L HCl 100ml *配制好的酶用
5ml小瓶分装，保存于冷冻箱，用前拿出来溶解。

（六）结果观察（一）胞浆阳性:
（六）结果观察（一）胞浆阳性
（二）胞核阳性:
（二）胞核阳性
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二、常见问题及对策
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由于免疫组化染色过程有许多步骤和环节，每一个步骤和环节都可能影响到染色的最终结果，因此，要做好一张高质量的免疫组化切片并不是一件很容易的事，需要病理技术员和医生密切配合，共同努力才能保证做出合格的免疫组化切片。

根据我们多年的经验，发现目前，免疫组化制片过程中常见的问题主要有如下几点：
：
常见问题1、组织的前期处理2、脱片问题3、阴性片4、背景染色
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（一）组织的前期处理要规范固定：新鲜标本一定要及时固定，离体后30min 内固定,大标本需切开固定（以防止组织内自溶，抗原被破坏），固定时间不要超过24小时，以免抗原被封闭，影响结果的表达；固定剂：10%中性甲醛，4%
多聚甲醛取材：一般为2x2x0.2cm脱水、透明要充分
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（二）脱片问题：这是由于玻片处理不当、切片太厚或组织特殊引起。

玻片的处理：我们应该将玻片清洗干净。

新购买的载玻片用洗衣粉浸泡10小时左右——自来水冲洗干净——蒸馏水冲洗2遍，烤干——浸泡防脱片剂多聚赖氨酸——烤干备用。

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多聚赖氨酸的浸泡从公司购买的多聚赖氨酸一般用双蒸水按1:10稀释；每张玻片必须浸泡多聚赖氨酸5min以上，烤干备用；注意已浸泡多聚赖氨酸的玻片应保持干燥，防止长霉
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切片不能太厚，以2-3um为宜，漂片要平整，不能有皱褶、气泡，烤片需60℃，15h以上。

对于骨组织和纤维成分较多的组织如乳腺、皮肤特别容易脱片，应特别注意切薄片，最好不超过2um厚，必要时可切片后先做微波1—2min,再烤片，以使组织粘贴牢固。

（三）阴性片染色结果中看不到任何阳性信号，出现这种现象有两种可能：真阴性结果：整个染色过程没有出现问题，组织或细胞确实不表达与抗体相关的抗原。

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假阴性结果：假阴性结果的原因可有：1、选错蜡块，切片中根本就不包含所预期检查的组织或细胞，因此我们选择蜡块时要注意不要选错。

2、组织未进行抗原修复或修复方法不当，抗原得不到表达，因为有的抗原需热修复，有的需酶消化，才能表达。

3、一抗失效，二抗、三抗使用不当。

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3、一抗失效，二抗、三抗使用不当。

在购买抗体时，我们要特别注意抗体的匹配问题。

我们知道一抗有的来源于鼠,有的来源于兔,因此我们在购买二抗时要注意:对于来源于鼠的一抗,必须购买抗鼠的二抗;对于来源于兔的一抗,必须购买抗兔的二抗才能相匹配，现在许多试剂公司有鼠兔通用的二抗购买，解决了这个问题。

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解决假阴性染色的办法首先选择正确的蜡块和抗原修复方法，注意抗体的有效期和抗体匹配问题；同时设立“阳性对照”。

阳性对照片可以从公司购买，亦可自己准备。

如果阳性对照有表达，说明染色过程和试剂无问题。

反之，表明染色过程中某个环节或试剂出了问题，应一一寻找原因。

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阳性库的建立对于阳性对照，顺便提一句，作为病理科医生和技术员，我们应善于从平常的工作中收集阳性蜡块，建立自己的阳性对照库，便于随时取来作阳性对照。

具体办法：工作中发现表达很好的组织立即将其蜡块收集起来，集中放入中空干燥器中，登记日期、蜡块号码，染色方法，抗原修复方法，阳性抗体名称、
购买公司。

并存入电脑。

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（四）背景染色免疫组化除正常的真实阳性信号外，常常会遇到不正常的背景着色，这些非正常的着色主要有以下几种：
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1、切片全着色切片全着色是指整个切片都染上颜色（图1），着色的强度可深可浅，分不清哪些组织是阳性，哪些组织是阴性，出现这种现象的原因有：
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1.1、抗体浓度过高，主要是一抗浓度过高，应该在每次使用新的浓缩型抗体之前先做预实验，确定一个最佳浓度。

1.2、一抗变质、抗体孵育时间过长、或者温度过高，因此操作时应注意抗体的有效期，同时严格按照操作规程进行，Slide 47: 1.3、组织变干：抗原修复时修复液溢出后未及时补充液体使组织变干、染色切片太多、动作太慢、抗体流失等都可造成组织变干。

操作要认真仔细，采用PAP 笔画圈，可以有效避免抗体流失，也能提高操作速度。

1.4、DAB变质或显色时间太长：DAB最好现用现配，显色在显微镜下监控，达到理想的染色程度时立即终止反应。

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2 、切片边缘着色切片边缘着色也是一种非常常见的现象，这种现象称为边缘效应（图2）。

产生的原因：
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2.1、切片上滴加的试剂未充分覆盖组织，边缘的试剂容易首先变干，浓度较中心组织高而致染色深。

解决办法：滴加试剂应超出组织边缘2 mm。

为了避免油剂表面张力的影响，PAP笔画圈时应超过组织边缘3-4 mm。

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2.2、组织边缘与玻片粘贴不牢，边缘组织漂浮在液体中，每次清洗不易将组织下面试剂洗尽。

解决办法：制备优质的多聚赖氨酸玻片，切出尽量薄的组织切片，组织的前期处理应规范，尽量避免选用坏死组织块。

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3、切片着色不均匀是指组织呈灶片状着色（图3）。

产生这种现象得原因有： 3.1、裱片时水未排尽，在局部形成气泡使组织突起，染色时试剂渗入后不易洗尽，导致显色过深。

还有气泡也可引起阴阳分明的着色，只是不着色区域是圆形，由于气泡中含气，试剂被推到周围，因此，气泡中心的组织不着色，周围组织深染。

滴加试剂时手法要轻，有气泡时用牙签捅破。

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3.2、染片盒不平，切片倾斜，虽然开始试剂已全部覆盖了组织，但后来试剂流向一边，部分组织未被试剂覆盖。

3.3、坏死组织灶，组织坏死后细胞破坏、酶的释放、蛋白游离、分解，肽链残段可能与一抗或/和二抗结合导致着色。

在
选择蜡块时应避免选择坏死组织较多的蜡块。

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4、其他背景染色4.1、胞浆里含有较多的蛋白质，许多非特异性的染色除了见于间质也可出现在胞浆中。

这种原因造成的着色，可以通过血清封闭解决。

4.2、因内源性酶造成的着色，如血红蛋白（红细胞）、肌红蛋白（肌细胞）、细胞色素（粒细胞、单核细胞）、过氧化氢酶（肝、肾），可用过氧化氢进行阻断。

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4.3、内源性生物素的着色最具有欺骗性，因为它广泛存在于组织细胞中，加热抗原修复后亦可造成内源性生物素暴露，而且以颗粒状形式存在于胞浆中，与胞浆阳性非常相似（图4）。

解决办法是用鸡蛋清封闭或采用非生物素检测系统Polymer 两步法（EliVision）可避免生物素干扰。

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三、抗体的保存储存抗体的容器应由不吸附蛋白质的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。

我们使用的绝大多数抗体都是从公司购买的已稀释的即用型抗体，应保存在4－8℃冰箱中，并注意其有效日期。

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浓缩型抗体一般应保存于-20℃条件下，并避免反复冻融，冷冻的抗体溶解时应缓慢地解冻，绝对避免用高温快速解冻。

被细菌污染的抗体会出现假阳性，应
防止细菌污染。

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四、病理科建立免疫组化室需要的基本设备空调；切片机；漂片烤片机；冰
箱（4℃.-18℃）；恒温干燥箱；37℃隔水式恒温箱；微波炉;高压锅；电磁炉孵育盒（有机材料）；不锈钢或塑料耐高温切片架；
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1000U1、100ul、10ul移液器和配套的tip头；PAP油性笔；定时器；放水瓶；错层实验台。

免疫组化自动染色仪。

脱落细胞制片技术:
脱落细胞制片技术基本程序：1、编号：申请单、登记本、标本、玻片2、登记姓名、标本来源、临床诊断3、制片：主要介绍痰液、尿液、胸腹水标本的制作4、诊断
一、痰液标本的采集与涂片:
一、痰液标本的采集与涂片采集方法：清晨空腹时，先嘱病人将口内唾液吐出，再嘱病人从肺部深处用力咳嗽，咳痰3~6 口，总量5ml左右，置于痰杯或厚纸盒内，连续送检3天，每天一次；痰液标本必须新鲜，最好在1小时内涂片固定。

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选材涂片1、一般选取血丝及其附近；鲜血旁的粘液；灰白、细丝线样痰丝；透明痰液有时也有很多癌细胞。

2、血块、脓块、灰黑色胶冻样颗粒和泡沫等常无癌细胞，选材时应将其除去。

3、涂片：一般涂2张，用细竹签或眼科镊将其拉平或将2张玻片推拉，厚约1mm，不能太厚，也不能太薄。

自然凉干或用冷风吹干固定。

二、胸腹水、尿液标本的涂片:
二、胸腹水、尿液标本的涂片1、临床送检的胸腹水、尿液标本一般有500ml 左右，先将标本静置10分钟，轻轻倒出上清液，保留底部沉淀约20~40ml；2、将底部沉淀摇匀，加入2支10ml的离心管内（尿液标本需4支离心管），经天平平衡，放入离心机内，以每分钟1000~2000转的速度离4 10min;
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3、取出离心管，将上清液全部倒去，留0.5ml左右的管底沉淀和剩余液体（尿液标本因细胞少，要尽量吸干上清液将几管的细胞混在一起涂片）；
4、用吸管吸取红细胞与上清液之间的白膜层，置于干净涂片上，每个标本均匀涂片2张，凉干或用冷风吹干固定。

三、涂片制备注意事项:
三、涂片制备注意事项1、动作要轻：避免人为损伤细胞。

2、厚薄要适宜：涂片太厚，细胞重叠，不利于镜检；涂片太薄，细胞太少，容易漏诊。

3、防止细胞脱落：对蛋白含量少的标本（如尿液标本）细胞不易于黏附在玻片上，染色过程中细胞容易脱落，应先在玻片上涂抹蛋白甘油以防细胞脱落，再涂标本。

四、固定:
四、固定常用固定剂1、95%酒精：最常用，方便2、乙醚酒精：渗透性强，固定效果好95%酒精49.5ml乙醚49.5ml冰醋酸1 ml固定时间：一般需15~30分钟
五、常用染色方法及步骤:
五、常用染色方法及步骤苏木素一伊红（HE）染色法1、涂片固定10~30min 后，自来水洗；D.w洗2、浸入苏木素染液中染5~10min,水洗1min 3、0.1% 的盐酸酒精分化数秒钟，水洗4、饱和碳酸锂返蓝1~2min，水洗10min 5、伊红染1~2min 6、70%、80%、95%、无水酒精各脱水1min 7、吹干，中性树胶封片，贴标签瑞氏染色法
六、胸腹水脱落细胞快速制片法:
六、胸腹水脱落细胞快速制片法1、收集细胞：用细胞采集器收集。

先将注射器与三通锥管紧密连接，然后将带有浓缩器一端的软管置于待检标本中，另一端置废液缸，缓慢均匀地反复抽推注射器，至感到抽吸吃力或抽完为止。

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2、涂片：打开浓缩器，取出过滤膜片，将膜片有细胞的一面与用多聚赖氨酸处理的载玻片很好地接触，将细胞均匀黏附于载玻片上，冷风吹干。

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3、固定及染色将上述涂片置FAAPT固定液中固定1~2min,蒸馏水洗后入已预温到60℃的苏木素染液中染色1min；盐酸酒精分色，碳酸锂返蓝；伊红染胞浆，梯度酒精脱水，中性树胶封片。

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FAAPT固定液10%的副尔马林15ml冰醋酸3ml 95%的乙醇40ml苦味酸/95%乙醇饱和液42ml Triton X-100 0.2ml
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优点：1、制片时间短：一般每例标本从制片到染色完成,只需7~8分钟。

2、
涂片细胞成分多，漏诊可能性小，准确率高。

缺点：成本比较高。