全反式维甲酸和Caspase抑制剂Z-VAD-FMK对胰腺癌细胞凋亡的作用

全反式维甲酸和Caspase抑制剂Z-VAD-FMK对胰腺癌细
胞凋亡的作用
夏璐;鲍英;袁耀宗;张学军
【摘要】目的观察全反式维甲酸(ATRA)对体外胰腺癌细胞生长的影响以及caspase抑制剂Z-VAD-FMK对细胞凋亡的作用.方法胰腺癌细胞PaTu8988与ATRA或与ATRA+caspase抑制剂Z-VAD-FMK共同孵育后,用MTT方法观察细胞活性,观察细胞超微结构改变,DNA断裂分析,流式细胞仪检测凋亡细胞比例和测定caspase-3活性.结果ATRA对细胞的生长有明显的抑制作用.ATRA诱导后电镜和DNA断裂分析发现典型凋亡特征.与ATRA处理组相比,ATRA和Z-VAD-FMK 联合作用对细胞凋亡比例无影响.ATRA组caspase-3蛋白的活性随孵育时间延长而升高,且与凋亡比例相关,Z-VAD-FMK处理组caspase-3活性明显下降.结论ATRA能够抑制胰腺癌细胞生长并诱导细胞凋亡.同时,与Z-VAD-FMK联合作用能抑制caspase蛋白活性,但未使细胞凋亡比例相应降低,提示在胰腺癌凋亡过程中可能有其他蛋白酶的作用.
【期刊名称】《中华胰腺病杂志》
【年(卷),期】2003(003)004
【总页数】5页(P198-202)
【关键词】胰腺肿瘤;细胞凋亡;Caspases;维生素A酸类
【作者】夏璐;鲍英;袁耀宗;张学军
【作者单位】200025,上海,第二医科大学附属瑞金医院消化科;200025,上海,第二医科大学附属瑞金医院消化科;200025,上海,第二医科大学附属瑞金医院消化科;中科院上海生命科学院生化与细胞生物研究所细胞分子生物实验室
【正文语种】中文
【中图分类】R73
胰腺癌被认为是极易出现对化疗耐药的恶性肿瘤之一。

发现可有效诱导胰腺癌细胞凋亡的药物，并研究其相关作用机制十分重要[1]。

1909年Stepp最早报告了维生素A类对细胞生长的重要性。

以后在医学界，不断有关于该类化合物防癌抗癌的科学报告[2]。

1980年Breitman等发现维甲酸类似物如13-cis RA及全反式维甲酸(ATRA)可诱导体外HL-60及APL(急性早幼粒细胞白血病)细胞系分化。

1986年ATRA首先在临床中应用于APL患者的治疗[3]。

目前已有许多文献报道了ATRA诱导细胞分化过程中信号转导途径、基因表达方式及细胞周期的变化等。

研究还发现ATRA对前列腺癌、肝癌等一些实质性肿瘤细胞也有诱导细胞凋亡的作用[4,5]。

细胞凋亡是一个由启动因子、各种效应因子和抑制因子参与的复杂的蛋白酶级联反应过程。

而各种外界因素对细胞凋亡的作用，牵涉到影响细胞信号转导、改变细胞凋亡的酶学基础和调控凋亡相关基因等各个方面。

caspase蛋白酶家族也称为ICE/CED-3家族，是一组与细胞因子成熟和细胞凋亡有关的蛋白酶，它们直接参与了凋亡早期启动和凋亡信号的传递[6]。

维甲酸类诱导肿瘤细胞凋亡的确切机制尚不明确，对其在胰腺癌中的作用更少有报道。

本研究旨在观察ATRA对人胰腺癌细胞的体外生长的影响、ATRA诱导细胞凋亡作用及此过程中caspase-3的变化以及应用caspase抑制剂对凋亡的影响，
为维甲酸类药物诱导肿瘤细胞凋亡的分子基础研究提供更多的信息。

材料与方法
一、细胞株及细胞培养
人胰腺导管细胞癌细胞株PaTu 8988由第二军医大学附属长海医院消化科李兆申
教授惠赠。

单层培养于含10%灭活小牛血清的低糖DMEM培养液(Gibco)中，在37℃，5% CO2的培养箱中培养。

将对数生长期细胞接种后，隔夜待细胞贴壁时
进行实验。

二、分组
ATRA组：ATRA(Sigma Inc.)以0.01 mol/L的浓度-20℃避光储存于100%乙醇中。

以无水乙醇将ATRA的工作浓度调整为0.01、0.1、1和10 μmol/L。

ATRA
和caspase抑制剂Z-VAD-FMK(Promega)联合作用组(联合组)的使用终浓度分别为1 μmol/L和20 μmol/L，每隔48 h更换培养液及药物。

对照组加入等体积的
无水乙醇( < 0.1%, V/V)，此浓度下乙醇对细胞生长无影响。

三、细胞活性测定(MTT)
按MTT活细胞染色法。

取对数生长期的胰腺癌细胞用0.03%胰酶消化制细胞悬液，以含10%小牛血清低糖DMEM培养液稀释成105个/ml，以每孔100 μl加入96孔培养板。

37℃、5% CO2培养24 h，每孔分别加入0.01、0.1、1和10
μmol/L ATRA继续培养12、24、48、72及96 h，每一浓度设三个复孔，并设
对照孔(未加药物)和空白孔(未加细胞)，每孔加MTT(1 mg/ml)100 μl，37℃反应
4 h后经板式离心，弃去培养液及未反应MTT，每孔加入100 μl二甲亚砜，反应
30 min后测每孔570 nm波长处吸光度(A值)。

四、细胞凋亡检测
流式细胞仪细胞按5 × 105细胞/瓶接种在100 ml培养瓶中，加入ATRA后分别
于0、24、48和72 h收集细胞，PBS洗一次，加1 ml预冷PBS重悬细胞，加
10 ml 70% 乙醇4 ℃固定过夜，加入10 μl RNase (10 mg/ml)后37℃放置30 min，以10 μl碘化丙啶(PI，1 mg/ml)染色。

计算各时间点的细胞凋亡比例。

五、Caspase-3活性测定
应用Caspase-3活性测定试剂盒检测caspase-3蛋白活性。

按试剂盒说明书进行，检测原理是凋亡细胞中caspase-3激活后，可将底物液中Ac-DEVD-pNA中的
p-硝基苯胺(pNA)游离出来，游离的pNA发黄光，可用分光光度计在405 nm检测。

切割所导致产生的黄光的量与样品中DEVDase活性成正比，故测定游离AFC 浓度以表示caspase-3的活性。

六、凋亡的形态学检测
透射电镜标本经戊二醛和饿酸双重固定，丙酮脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸枸椽酸电子又重染色，透射电镜观察。

七、DNA断裂分析
总DNA的提取参照Mittler等人[7]的方法进行，将约10 μg 提取的总DNA加入2%琼脂糖凝胶(含5 μg/ml溴化乙锭)，电泳缓冲液为0.5 × TBE，恒压100 V下
电泳3 h，于紫外观测仪上观察结果。

典型的凋亡细胞DNA被切成一系列以
180 ～ 200 bp长度为单位的多聚体，从而在琼脂糖凝胶上呈梯状分布。

八、统计分析
采用SAS软件进行t检验，P < 0.05表示有统计学意义。

结果
一、ATRA对细胞活性的影响
ATRA作用12 h后细胞的生长抑制作用即开始显现，其中1 μmol/L和10
μmol/L浓度的ATRA对胰腺癌细胞的体外生长有明显的抑制作用，在作用72 h
后此抑制作用与用药前相比有显著差异，而0.01、0.1 μmol/L浓度组虽对细胞生长有一定抑制作用但效果不显著(图1)。

图1 不同浓度ATRA对PaTu-8988细胞生长的抑制作用
二、ATRA处理组和ATRA + Z-VAD-FMK联合处理组诱导的PaTu 8988细胞凋亡
各组在各时间点所诱导的细胞凋亡率如图2所示。

与对照组相比，ATRA组及ATRA+Z-VAD-FMK联合组作用72 h后的细胞凋亡率明显增加(38.79% vs 15.32%，36.93% vs 15.32%，P < 0.05)，但ATRA组和ATRA + Z-VAD-FMK 组在72 h时细胞凋亡率无明显差异(36.93% vs 38.79%, P > 0.05)。

图2 不同组别的PaTu-8988细胞凋亡
三、Caspase-3 活性
药物作用48 h后ATRA组与联合组相比caspase-3 酶活性有显著差异(0.078 vs 0.049, P < 0.05)，72 h也有相似的结果(0.114 vs 0.042，P < 0.05)。

说明随着药物作用时间的延长，Caspase-3活性逐渐增加，但在同时使用Z-VAD-FMK，其活性显著受到抑制(图3)。

图3 不同组别不同时间点的caspase-3活性
四、凋亡细胞形态学检测
如图4所示，ATRA诱导后PaTu 8988细胞呈现凋亡初期胞体收缩、染色质边聚的典型现象，凋亡细胞的典型形态改变如胞质的固缩，染色质浓缩成半月形或帽状附于核膜，但核的碎裂和凋亡小体形成等不很明显。

五、DNA 断裂分析
经ATRA处理72 h后的细胞总DNA在琼脂糖凝胶上呈典型的梯状分布，说明ATRA有明显的诱导凋亡作用。

讨论
正常情况下体内细胞的存活和死亡通过复杂的细胞间和细胞内信号转导而保持相对平衡，一般针对肿瘤细胞进行化疗的作用机制主要是诱导肿瘤细胞的凋亡，但如果
靶细胞对此类药物的诱导凋亡作用不敏感，则可能导致治疗失败。

研究证实维甲酸类能调节体内细胞增殖、分化以及凋亡[8]。

许多文献报道维甲酸类由于对许多不同来源的肿瘤细胞均有诱导凋亡作用因而用于肿瘤细胞可起到抑瘤效果[9-11]。

这方面的研究同样在胰腺导管细胞癌中也有报道，主要是在对胰腺癌细胞株的体外试验以及动物实验中得到了证实[12] 。

我们的研究也发现体外试验中一定浓度的ATRA能抑制人胰腺癌细胞PaTu 8988生长及诱导细胞的凋亡。

图4 透射电镜观察ATRA处理后PaTu-8988凋亡细胞的形态( × 4 800)
1996年Alnemri等提出将人源性的ICE/CED-3蛋白酶统一命名为“天冬氨酸特
异性半胱氨酸蛋白酶”(cysteinyl aspartate-specific protease, caspase)，并将
已经克隆出来的人的ICE蛋白酶依次命名为caspase-1 ～ 10[6]。

作为决定细胞
命运的活性分子，caspase具有复杂的功能和调控方式。

有人将其称为凋亡的效应器，它们在凋亡程序的启动及执行过程中，起了非常重要的作用，在凋亡的晚期它们作用于不同凋亡底物(主要是一些DNA酶和一些细胞骨架蛋白)，产生细胞皱缩，膜出泡，DNA断裂等凋亡特征现象。

其中caspase-3是凋亡主要的执行者之一，研究发现在凋亡的早期阶段caspase-3即被活化并成为细胞进入凋亡阶段的一个
显著标志[13]，而且几乎在所有的凋亡中，caspase均呈活化状态[14]，提示此蛋白酶家族在细胞凋亡中的重要性。

caspase-3最主要的底物是多聚(ADP-核糖)聚
合酶PARP[poly(ADP-ribose) polymerase]，该酶与DNA修复、基因完整性监
护有关。

本研究在全反式维甲酸对中分化人胰腺癌细胞株的体外试验中发现其显著的诱导凋亡作用，凋亡细胞出现了典型的形态学特征和DNA梯形电泳条带，而且此过程中凋亡的水平与caspase-3的水平呈正相关，说明在ATRA诱导胰腺癌细
胞凋亡的过程中，活化的caspase-3起了重要的作用。

Z-VAD-FMK，一种可掺
入细胞的全caspase抑制剂，这一肽段在天冬氨酸P1位点呈O-甲基化，能提高
其稳定性和细胞通透能力。

我们发现应用了Z-VAD-FMK后较ATRA处理组细胞
的caspase-3活性明显受抑制，但此时的细胞凋亡率并未相应下降，提示ATRA
诱导细胞凋亡可能不完全依赖蛋白酶caspase活化。

类似的结论在以往文献中也有报道。

Quignon等[15]认为PML诱导的细胞凋亡信号途径不依赖重要的凋亡蛋白酶caspases的活化，因为PML诱导的细胞凋亡在
缺乏caspase-3活化的情况下发生。

caspase抑制物如zVAD则能加速PML诱导的细胞凋亡。

Wang等[16]也提出PML是多种凋亡诱导剂如死亡受体Fas和caspase、IFNs、TNF、ceramide及DNA损伤诱导的凋亡所必需的。

我们的研究结果证实caspase-3对ATRA诱导的胰腺癌细胞PaTu-8988凋亡有
重要作用，其活化水平与细胞凋亡率相关。

但抑制 caspase蛋白酶活性并未完全
阻断细胞凋亡的发生提示可能有其他的蛋白酶类参与ATRA诱导细胞凋亡的过程。

凋亡的发生具有复杂的调控方式，对于维甲酸诱导胰腺癌细胞凋亡的分子机制，尚有待于进一步的研究。

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