FABP4在妊娠期高血压疾病胎盘滋养细胞免疫炎症反应中的作用研究

FABP4在妊娠期高血压疾病胎盘滋养细胞免疫炎症反应中的
作用研究
毛彩艳;姜怡邓;张辉;李旭生;杨松昊;邓梅;丁宁;吴凯;杨晓玲;张慧萍
【摘要】目的探讨脂肪酸结合蛋白4(fatty acid binding protein 4,FABP4)在妊
娠期高血压疾病胎盘滋养细胞免疫炎症反应中的作用.方法体外培养人胎盘滋养细胞株(HTR-8),分别加入0、10、100、500、1 000 μmol·L-1 N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME),孵育48 h后,采用ELISA检测炎症因子IL-6、TNF-α改变;qRT-PCR、Western blot检测FABP4 mRNA和蛋白表达;构建FABP4腺病毒过表达载体转
染细胞后,采用100 μmol·L-1 L-NAME干预,ELISA分析炎症因子IL-6、TNF-α的变化.结果与对照组比较,L-NAME干预组IL-6、TNF-α及FABP4表达量明显增高(P<0.01);过表达FABP4组与对照组相比,炎症因子IL-6、TNF-α明显增加
(P<0.01).结论 FABP4参与了妊娠期高血压疾病胎盘滋养细胞免疫炎症反应的调控.%Aim To investigate the role of fatty acid binding protein 4 (FABP4) in placental trophoblastic immune response in patients with hypertensive disorder complicating pregnancy. Methods The human placental trophoblast cell line (HTR-8) was cultured in vitro and incubated with L-NAME for 0, 10, 100, 500 and 1 000 μmol·L -1 for 48 h. The levels of IL-6 and TNF-α were analysed by ELISA. The Mrna and protein expression levels of FABP4 were detected by Western blot and Qrt-PCR. The cells transfected FABP4 adenovirus expression vector were intervented with 100 μmol·L -1 L-NAME. Then, the levels of IL-6 and TNF-α were determined by ELISA. Results Com-npared with the control group, the expression levels of IL-6, TNF-α and FABP4 were significantly increase d in the intervention
group(P<0.01). Meanwhile, the expression levels of IL-6 and TNF-α were significantly increased in the overexpressed FABP4 group, compared with the control group(P<0.01). Conclusion FABP4 is involved in regulating the trophoblastic immune-inflammatory response in patients of hypertensive disorder complicating pregnancy.
【期刊名称】《中国药理学通报》
【年(卷),期】2017(033)008
【总页数】6页(P1126-1131)
【关键词】脂肪酸结合蛋白4;妊娠期高血压疾病;滋养细胞;IL-6;TNF-α;N-硝基-L-精氨酸甲酯
【作者】毛彩艳;姜怡邓;张辉;李旭生;杨松昊;邓梅;丁宁;吴凯;杨晓玲;张慧萍
【作者单位】宁夏医科大学基础医学院,宁夏银川 750004;宁夏医科大学基础医学院,宁夏银川 750004;宁夏医科大学临床医学院,宁夏银川 750004;宁夏医科大学总医院,宁夏银川 750004;宁夏医科大学基础医学院,宁夏银川 750004;宁夏医科大学基础医学院,宁夏银川 750004;宁夏医科大学基础医学院,宁夏银川 750004;宁夏医科大学基础医学院,宁夏银川 750004;宁夏医科大学基础医学院,宁夏银川750004;宁夏医科大学总医院,宁夏银川 750004
【正文语种】中文
【中图分类】R321.4;R392.12;R544.1;R714.252;R714.56;R977.6
妊娠期高血压疾病(hypertension disorder complicating pregnancy，HDCP)是孕妇因妊娠后内环境改变而导致的以一过性血压升高、全身小动脉痉挛等致血管内
皮广泛损伤为主要特征的严重危害母婴健康的疾病，是引起孕产妇和围生儿死亡的主要原因之一[1]。

胎盘滋养细胞是妊娠得以建立和维持的基础，参与局部的免疫
调节[2]，在免疫调节中与其它来源的细胞因子共同发挥重要的作用，分泌集落刺
激因子-Ⅰ(colon y stimulating factor-Ⅰ， CSF-Ⅰ)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激
因子(granulocyte macrophage-colony stimulating factor，GM-CSF)、白介素-1(interleukin-1，IL-1)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)、肿瘤坏死因子-
α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等[3]。

脂肪酸结合蛋白4(fatty acid binding protein 4, FABP4)分布于各种正常组织和细胞中，其在机体炎症、代谢
及免疫等方面均具有重要的调节作用[4]。

同时FABP4也是一类分子量较小，且对脂肪酸有高亲和力的可溶性载体蛋白，在糖脂代谢、炎症反应中起了重要的作用[5]。

且HDCP是以血管内皮细胞受损、功能紊乱和胎盘血流灌注量减少为特征的一种妊娠期特有疾病，因此，阐明FABP4在HDCP胎盘滋养细胞免疫炎症反应中的作用，将为进一步深入研究HDCP的作用机制提供实验依据。

1.1 仪器与试剂电泳仪、凝胶成像仪(Bio-Rad，美国)；酶标仪、荧光定量PCR仪(上海枫岭生物技术有限公司)。

总RNA提取试剂盒(北京天根生物技术有限公司)；逆转录试剂盒、荧光定量PCR(qRT-PCR)试剂盒(Fermentas公司,英国)； BCA蛋白含量检测试剂盒(凯基生物科技发展有限公司，南京)；FABP4抗体(Abcam)；引物由上海生工公司合成；DMEM F12培养基、胎牛血清、100 kU·L-1青霉素和0.1 g·L-1链霉素(Gibco 公司)；N-硝基-L-精氨酸甲酯(N- nitro-L-arginine methylester，L-NAME)(Sigma公司)。

1.2 细胞培养人胎盘滋养细胞株(HTR-8)购自复旦大学上海细胞库，采用DMEM
F12培养基培养细胞(含10%胎牛血清、100 kU·L-1青霉素和0.1g·L-1链霉素)，培养条件为:37 ℃、5%的CO2。

不同浓度的L-NAME(10、100、500、1 000
μmol·L-1) 干预48 h，收集细胞用于后续实验。

1.3 qRT-PCR法检测IL-6、TNF-α、FABP4 mRNA表达按照总RNA抽提试剂盒说明书抽提总RNA。

取5 μL RNA样品进行凝胶电泳，琼脂糖胶浓度为1.0% ，
电压为120 V，电泳15 min，利用凝胶成像系统检测RNA的完整性和纯度。

在NCBI GenBank 数据库中查询IL-6、TNF-α、FABP4，利用Premier 5.0设计荧
光PCR引物，IL-6的引物为上游：5′-GGTGAGTGGCTGTCTGTGTG-3′，下游：5′-TTCGGTCCAGTTGCCTTC-3′。

TNF-α引物为上游：5′-AGCCCATGTTGTAGCAAACC-3′，下游:5′-GCTGGTTATCTCTCAGCTCCA-3′。

FABP4引物为上游:5′-AAGAGAAAACGAGAGGATGATAAAC-3′，下游:5′-ATGCGAACTTCAGTCCAGGTC-3′。

GAPDH引物为上游：5′-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3′，下游：5′-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3′。

按反转录试剂盒说明书加入相应试剂反转录成cDNA，以cDNA为模板进行qRT-PCR。

荧光PCR反应条件为: 95℃预变性2 min，95℃变性10 s、59℃退火30 s，72℃延长30 s，扩增40个循环。

待反应结束后，结合扩增曲线及熔解曲线分析，选择符合要求的qRT-PCR原始数据，用内参基因GAPDH 校正，结果用2-△△CT 法分析。

1.4 Western blot检测FABP4蛋白表达收集实验各组滋养细胞，提取总蛋白并
定量；取30 μg总蛋白，8%分离胶和4%浓缩胶进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；然后，将蛋白质电转移至孔径0.45 μm硝酸纤维素薄膜；取出含目的蛋白的膜，用含5%脱脂奶粉的PBST 封闭1 h；加入一抗(免抗FABP4，1 ∶1 000；鼠抗β-actin，
1 ∶1 000)，4℃过夜；PBST 洗涤10 min，3次；再加入HRP 标记的羊抗兔或鼠二抗(均1 ∶5 000)，摇床孵育
2 h；PBST 洗涤10 min，3次；用SuperSignal West Pico 化学发光底物显影，胶片定影。

图片用Image-Pro Plus 6.0软件进行光密度值分析，以β-actin为内参对照。

1.5 腺病毒转染委托上海汉恒生物公司构建FABP4腺病毒过表达载体，感染前选
择生长状态较好的HTR-8细胞进行培养，吸去旧的培养液，PBS洗1遍，然后加入调整好滴度的腺病毒液，病毒感染2 h后，将培养液倒掉，加入新培养液3 mL，继续培养，病毒感染48 h后，荧光倒置显微镜下观察Ad-FABP4组绿色荧光，检测是否转染成功。

1.6 ELISA检测炎症因子的表达设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50 μL;样品孔中加待测样品10 μL，再加稀释液40 μL；除空白孔外，标准品孔和样品孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100 μL，封板膜
封闭，37℃水浴锅或恒温箱温育60 min；弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液静置1 min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次；每孔加底物A、B各50 μL，37℃避光孵育15 min；每孔加入终止液50 μL，15 min内，450 nm波长处测定各孔的OD值。

1.7 统计学分析数据以表示。

多样本均数间比较采用One-way ANOVA检验，组间的两两比较采用Student-Newman-Keuls检验。

2.1 胎盘滋养细胞免疫炎症因子IL-6、TNF-α的表达与对照组比较，各组炎症因
子IL-6表达量随着L-NAME剂量增大而逐渐增加(Fig 1A)，差异具有显著性
(P<0.05)；而TNF-α表达量则从100 μmol·L-1 L-NAME干预组开始，随着剂量增大呈逐渐降低的趋势(Fig 1B)，差异具有显著性(P<0.05)。

结果提示，IL-6、TNF-α可能参与HDCP的发生过程。

2.2 胎盘滋养细胞中FABP4表达不同浓度L-NAME干预滋养细胞48 h后，qRT-PCR以及Western blot检测各组细胞FABP4的mRNA、蛋白表达。

Fig 2A结
果显示，100 μmol·L-1 L-NAME组中FABP4 mRNA相对表达量较对照组升高了2.5倍，差异具有显著性(P<0.01)。

Fig 2B蛋白表达趋势与FABP4 mRNA表达趋势相一致，100 μmol·L-1 L-NAME组中FABP4蛋白表达水平是对照组的2.6倍，差异具有显著性(P<0.05)。

2.3 Ad-FABP4对滋养细胞炎症因子IL-6、TNF-α表达的影响为进一步探讨FABP4在L-NAME对滋养细胞免疫炎症因子表达的影响，将FABP4重组包装的
腺病毒感染HTR-8细胞48 h，荧光显微镜观察，结果如Fig 3A所示，对照组中
无荧光，空质粒组和重组质粒组细胞中可见绿色荧光。

100 μmol·L-1 L-NAME干预转染慢病毒滋养细胞组48 h后，qRT-PCR以及Western blot检测各组细胞FABP4的mRNA、蛋白表达。

结果显示，Ad-FABP4组比空质粒组FABP4 mRNA升高了5.7倍，差异具有显著性(P<0.01)。

100 μmol·L-1 L-NAME干预
转染慢病毒组较Ad-FABP4组、100 μmol·L-1 L-NAME组FABP4 mRNA各升
高1.3倍、3.2倍(Fig 3B)，差异具有显著性(P<0.01)。

FABP4蛋白水平与FABP4 mRNA水平变化一致(Fig 3C)。

为明确FABP4对妊娠高血压胎盘滋养细胞炎症因子表达的影响，ELISA法检测各组细胞培养基上清中的炎症因子IL-6、TNF-α表达。

结果显示，与FABP4表达趋势相同(Fig 3D、3E)，差异具有显著性(P<0.05)。

提示FABP4在滋养细胞免疫炎症中起了重要作用。

胎盘是母体与胎儿间进行物质交换的器官，具有复杂的生理功能，其中胎盘滋养细胞是妊娠得以建立和维持的基础，占妊娠胎盘的主要部分[6]。

研究表明胎盘滋养
细胞功能异常与HDCP 密切相关，同时研究发现，HDCP患者血浆NO较正常孕妇明显下降，其下降的程度与病情严重程度呈正比，提示妊娠期间NO分泌不足
可能是HDCP的重要致病因素之一[7]。

适量的NO水平是保证子宫胎盘循环低阻、低压、高流量的关键，这是机体对正常妊娠的保护性机制。

L-NAME是一氧化氮
合酶抑制剂，可以抑制NO的产生[8]，进而导致胎盘螺旋小动脉痉挛引起HDCP。

因此，本实验利用L-NAME干预胎盘滋养细胞抑制NO的合成来模拟HDCP微环境，这将有利于阐明HDCP的发病机制，为临床防治HDCP提供实验资料。

免疫炎症反应是T淋巴细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞、树突细胞和肥大细胞的浸润导致的炎症过程，也是众多免疫炎性反应的共同致病途径。

免疫细胞产生和分泌的
一系列信号蛋白，如炎症因子IL-6、TNF-α等，可以调节炎症、免疫、造血系统
等一系列生理活动[9]。

IL-6 可通过体液和细胞免疫功能影响炎症、宿主防御和组
织损伤，是炎症免疫反应的重要介质。

TNF-α是一种对多种细胞的生长分化和功
能具有抑制或刺激多重效应的细胞因子，其主要生物学活性为引起炎症反应和抗肿瘤效应。

本实验结果显示，炎症因子IL-6表达量随着L-NAME剂量增大而呈剂量依赖性；而在L-NAME干预下，TNF-α表达量增加，差异有显著性。

由于L-NAME是一氧化氮合酶抑制剂，可以改变胎盘滋养细胞NO的含量引起HDCP，
而HDCP胎盘血流量下降，胎儿氧和营养物质的供应减少，使得胎儿处于急慢性
缺氧状态，可能有大量的炎性因子分泌，从而引起免疫炎症[10]，IL-6、TNF-α表达增加。

FABP4是近年新发现的细胞质基质蛋白家族中的一员，因最早在成熟脂肪细胞被
发现，故又称脂肪型脂肪酸结合蛋白。

脂肪酸结合蛋白家族包括9种高度保守的
细胞质基质蛋白[11]，可逆性地与各种疏水性配体相结合。

FABP4能够调节脂肪
细胞分化及糖脂代谢、调节巨噬细胞的胆固醇积聚、促进细胞的生长和分化、介导炎症反应等[12]。

本研究体外培养HTR-8，分别加入0、10、100、500、1 000 μmol·L-1 L-NAME，孵育48 h后，检测FABP4表达变化，发现随着L-NAME
浓度增大，FABP4表达增加。

为进一步明确FABP4在其中的作用，我们使用FABP4腺病毒过表达载体感染滋养细胞后发现，炎症因子IL-6、TNF-α的表达也进一步增加，这提示FABP4可以促进滋养细胞免疫炎症发生。

目前认为在脂肪组织中免疫细胞的积累,特别是巨噬细胞的积累对于脂肪组织的炎症反应十分重要[13]。

采用巨噬细胞系和脂肪细胞系共培养发现,脂肪细胞中FABP4的缺失将导致巨噬细胞炎性因子的表达减少[14]，这进一步佐证了FABP4在免疫炎症中的作用。

本实验证实了FABP4在胎盘滋养细胞免疫炎症中有重要作用，FABP4水平异常对
于预测HDCP的发生、发展有重要意义。

(致谢：本实验在宁夏医科大学基础医学院心脑血管重点实验室完成，感谢各位老师和同学们对本课题的大力支持和指导！)
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