酶的固定化发展进程

固定化酶的发展进程
Den Brady·Justin Jordaan
Received: 2 April 2009/Received: 19 June 2009/Accepted: 22 June 2009/Published online: 10 July 2009 © Springer Science+Business Media B.V. 2009
摘要
改善当前酶的载体固定化的策略，如今发展的方向都是使用杂交技术也就是通过多位点连接，从而提高酶的连接效率和稳定性。

最新的商品树脂展现出了经改善的蛋白质的可结合量。

最新的酶的自固定化方法（包埋法、交联法）在载体材料选择上正在蓬勃发展。

除此之外还有酶固定化材料（载体）的回收和回收后材料的稳定性（可再生能力），和酶的固定化的出现带来的好处，例如提高酶的活性，经修饰（固定化）后的酶在底物的选择能力上和酶簇反应上。

这些进展预示了酶的固定化技术在工业生产中的应用前景，同时意味着打开了新技术的大门。

关键词
生物催化剂、生物催化反应、酶、固定化
介绍
生物催化反应过程中，提高通过酶的固定化来实现酶的再生能力可在生产中减少成本，同时带来巨大额经济利益。

酶的固定化量的保持使固定化酶与产品的分离回收变得简单可操作，因此在生产中允许连续生产，同时减少了下游工程（分离工程）的困难性，也就是说减少了下游工程对蛋白质活性的影响。

酶的固定化在理想条件下（例如：酸、碱、有机溶剂和温度的提升）能提升酶的性能，同时这些因素阻碍着酶在工业化学合成上的应用。

不拘泥于在历史的长河中固定化酶明显的优点，估计只有20%的生物催化反应使用了固定化酶的技术。

然而在过去的几年中许多的令人感兴趣的新发展已经在文献上做了相应的报告并取得了专利许可，暗示着酶的固定化技术已经进展到令人兴奋的新篇章。

酶固定化类型
包埋法
包埋酶是一种典型的完成酶的聚合物的方法（图1），像是一个有机的聚合物或者是凝胶，它经常被看做是一个个体。

包裹材料将酶夹在其中是酶不直接与体系接触因此减少发酵液中气体气泡、剪切力、疏水溶剂对酶的影响。

但是包埋法生产的固定化酶也有它的缺点，它的缺点是容易结团从而限制酶的工作。

通常用包埋法制作固定化酶使用二氧化硅凝胶聚合物，是二氧化硅分子排列的酶的表面，一般通过将酶和二氧化硅凝胶溶解的疏水溶剂中。

Reetz和jaeger在1998年曾用烷基硅烷的前体（RSi（OCH3）3）或者通过RSi（OCH3）3和
Si（OCH3）3提供多相系并和凝胶将假单胞菌属的假单胞菌所产脂酶进行包埋。

通过调节聚合反应条件使聚合物表面产生多孔性的网状结构，同时聚合物的分子量是可调控的。

并使用一种特别的方法使其干燥，溶剂粒子的表面张力和凝胶聚合物的成分均可以调节表面空隙率。

这些凝胶是的排列是有顺序的。

密度逐层递减，因为凝胶固体（气体干燥），ambigels（更强的疏水性，通过稀释毛细管干燥从而控制压力极限收缩量），和aerogels（超临界干燥和可忽视的收缩）。

Santos等人对聚硅氧烷(POS)和聚乙烯基乙醇（PVA）混合物对链球菌属的南极链球菌产的脂肪酶B（简称CaL-B）包埋处理做出报告，同时证明了PV A在凝胶中的不同百分含量的情况下的每种粒子的物理性质，例如硬度和表面区。

Bruns和Tiller在2005年包埋山葵过氧化物酶和氯过氧化物酶的过程中使用纳米技术分离的两性网状一氧化碳共聚物和聚二羟乙基丙烯酸盐（简称PHEA）以及双官能团的聚二甲基硅氧烷（简称PDMS）。

实验初期酶放入加压的水媒介中，亲水性网状聚合物PHEA膨胀允许上升的酶在其间通过。

聚合物被放置在有机培养基（n-heptane）带亲水的网状聚合物收缩并独立开来，但是相互贯穿的疏水网状聚合物膨胀有效的捕获了酶，因此粒子会在有机溶剂中适当的催化反应。

不是所有的包埋载体都是含硅聚合物。

例如，Lee和Huang在2008年使用有生物活性的环氧化物水溶胶固定胰蛋白酶，该物质是一氧化碳共聚物N-异丙基丙烯酰胺(简称NIPAAm),缩水甘油基异丁烯酸（简称GMA）和N，N-二甲基丙烯酰胺（简称DMA；在Temino等人在2005年使用PVA在有机溶剂中固定去氢酶中提及）。

包囊法
类似于包埋法的一种方法，包围目标酶使其与反应体系分开，但是对于多种酶共同催化的生物反应该种方法有局限性（Lalonde和Margolin，2002）。

Zhang等人在2008年-2009年最新研发的一个新颖的方法，使用分层包埋法和包囊法（图2）使用羟甲基纤维素和氯化钙混合后包埋β-葡萄糖醛酸酶。

该溶液随后加入用针挤出1％（重量/体积）的藻酸盐溶液。

得到的软胶囊为酶提供了一个最适反应环境，然后用鱼精蛋白反应（小精氨酸丰富的蛋白质），并大量进入
胶囊，离子与表面剂海藻酸钠相结合。

然后用鱼精蛋白沉淀硅酸盐在其表面形成硬硅酸盐壳的粒子，从而防止压缩或膨胀。

最近的另一项进展是巧妙使用亲水性乳液聚乙烯亚胺（PEI）的溶液来包囊云芝漆酶（Kouisni和罗什福尔2008年）（图3）。

该方法使用交联剂（癸二酰氯），癸二酰氯可溶于有机溶剂（Rochefort等人，2008）。

PEI（高度支化聚合物）作为一种仅和酶溶于水相，随后的交联反应只发生在相界面，其中PEI和交联剂自由结合，从而形成球形PEI膜或微胶囊将酶包埋其内。

包埋法的理论基础
包埋法固定化的预处理可以为酶提供钢度，在不同的反应器配置中满足生物催化，如固定床反应器（Kunamneni等人，2008）。

但是，此法由于体积增大浓度遭到稀释，因此反应载体只占总催化剂的90%-99％之间。

（Sheldon 2007年a；Lalonde和Margolin 2002年。

）
吸附是操作相对简单和经济效益的高固定化方法，并不是使用化学法修饰酶分子，但它的局限性是蛋白酶容易析出，特别是在水溶剂中。

这可能会导致在放映过程中的困难和下游加工设计。

因此，该方法是最合适的脂肪酶固定化法。

使用有机溶剂，如商业酶固定剂：南极脂肪酶B（CAL-B），其中包括的Novozyme435（Novozymes）和CHIRAZYME（罗氏分子生化）。

大孔丙烯酸类聚合物树脂如AmberliteXAD-7（Takac¸和2007 Bakkal）可用于酶吸附，而CAL-B固定在VPOC1600（拜耳公司）中的方法被广泛地用于生产特种化学品（Miletic等人，2009年）。

或是，二氧化硅基材料如：变性的气凝胶（Gao等人，2009年），或硅藻土均可使用（Chaplin等人，2002年）。

固定荧光假单胞菌脂肪酶在硅藻土中的材料为薄荷醇，并且在八倍非专一性混合有机溶剂中发生反应。

吸附方法被经常使用在大规模工业化生产中，特别被固定的酶价格低廉时。

（Lalonde和Margolin，2002年。

）
离子结合技术是另一种简单的非共价固定化技术。

酶可以结合到有生物活性的多糖聚合物，如，葡聚糖，琼脂糖和壳聚糖。

这些聚合物载体均可用各种化学基
团作为官能能（R基），以实现离子交互，包括季铵盐、二乙基氨基乙基和羧甲基衍生物。

此方法已被用于市场中葡萄糖施加异构酶生产高果糖浆的生产（Lalonde和Margolin 2002年）。

另外此方法还可使用功能化大孔丙烯酸类聚合物树脂如AmberliteFPC3500（阳离子）或FPA54（阴离子）。

且反应是可逆的，虽然有利于载体的回收，蛋白质的析出是一个潜在的问题。

最有趣是在最近固定化方法的发展中，是区域共价结合法。

此法中赖氨酸氨基电子通常是（但不完全是）用作共价连接的位点。

赖氨酸是一种比较常见的组成蛋白质的氨基酸，经常位于蛋白三级结构表面，为上述反应提供活性，并提供了良好的粘结性、稳定性（Krenkova和Foret，2004年）。

环氧基团通常是在载体上的进行联动，因为它与载体是相对稳定的，可以结合赖氨酸，并在非常温和的反应条件结合蛋白质（Mateo等人，2007年c）。

固定化后的残留基团可用骤冷的伯胺盐，如：三（羟甲基）氨基甲烷（TRIS）进行去除，以防止进一步的非特异性反应的发生（Krenkova和Foret，2004年。

）。

最佳的固定化反是反应时间短和结合效率高，从而提供酶额刚性。

（mateo等人，2007年b，c。

）
以商业支持的Eupergit（赢创，以前德固赛），大孔球（170微米的平均直径）与环氧化物进行活化反应从而制成的，一个是由共聚合物甲基丙烯酰胺为前体的甲基丙烯酸缩水甘油酯、烯丙基缩水甘油醚和甲基丙烯酰胺，长期以来被用于酶的共价固定化，包括商业应用（Katchalski - Katzir和kraemer，2000年）。

Eupergitç固定的酶中有15%-100％是具有高活性的。

（Mateo等人，2007年c；Boller等人，2002;Bulawayo等人，2007。

）
近日，Sepabeads（Resindion）已经开始取代Eupergit。

Sepabead FP-EP是由聚甲基丙烯酸酯基树脂与环氧化物活化官能团与蛋白进行结合，并具有表面裂缝提供了更大的与酶结合表面积（因此具体酶催化剂装载能力）。

裂隙还提供了很多的保护滞留酶优点，如生产中产生气体气泡和剪切力。

（Mateo等人，2007年b。

）
酶的活性最大的影响因素是：酶的固定化方法和载体的理化性质（Bommarius 和Riebel，2004年；Lalonde和Margolin，2002年），与化学修饰导致酶失活的程度相仿。

例如，Sepabead EP不能固定马铃薯环氧化物水解酶，而Sepabead EP-NH2（其中添加了不同比例的环氧基和乙二胺）可固定马铃薯环氧化物水解酶但固定后酶仍然存在活性。

Sepabead EP-Cu（其中，按比例添加环氧基团与亚氨基和硫酸铜）给予了充分的固定作用且保证了酶的活性（大约70％），而变性的葡聚糖珠和苯乙烯氧化物能保证95%酶活。

（Mateo，等人2007a。

）
尽管在短时间内，结合后酶的稳定性和刚性都有所提高，它并不是保持高酶活的最优秀的载体，因为它会导致空间空隙的堵塞。

在疏水包被载体（1,6-二胺）和戊二醛硅胶载体固定脂肪酶的反应中均能有效保证酶活。

（Ozyilmaz，2009年）为了增强载体与酶的亲和力，正在进行树脂连接多个具有反应能力的基团的载体研发（Mateo等人，2000年），如Aepabeads EC-HFA与环氧乙二胺层组后的物质（Mateo等人，2003年，2007年c）。

基本原理是包夹氨基基团通过与蛋白羧基离子相互作用使其迅速结合蛋白。

这提升了靶蛋白的动力学性质，同时共价环氧基和赖氨酸结合后产生残留物。

同时杂合物更进一步的提生刚性，如：多亚基酶复合物（Bolivar等人，2009年）。

而且，这些变性提供一些选择性的蛋白质的位点，从而调节蛋白质的四级结构。

进一步多方位的发展，树脂环氧化物和硫的组合基，以游离半胱氨酸硫醇侧接一个蛋白质组（Grazu'等人，2003，2005）。

化学硫醇化的酶（其中所述硫醇化
合物充当一个离去基团）通过二硫键结合。

环氧树脂在结合相应的基团后与酶反应，在表面上通过胺基调节反应，以适应反应介质中较高pH值。

另一种有效的修饰方法是使用金属螯合物作为环氧树脂支架（Sepabead
EP-Cu）。

此产品仅用一步操作就可以纯化、固定和稳定poly-His-tagged酶（Pessela 等人，2003年）。

环氧化物树脂也可用于固定被修饰的多聚酶。

由于商业化对环氧树脂发展的支持，Eupergit C或叫Sepabeads不做如何保留了三聚尿苷磷酸或四嘌呤核苷磷酸的活性。

而是进行Sepabeads FP-EC3与PEI和如何组合葡聚糖醛和PEI研究，得到如何保存78%〜100％的活性方法（Rocchietti等人，2004年）。

葡聚糖醛涂层还可以防止酶由生产中的气泡导致的失活问题（Betancor等人，2005年）。

并对其他的聚合物组成也进行了深入研究。

（Miletic等人，2009年）。

一种新的方法，最近已被开发用于生产PEI树脂。

使PEI溶解在水包油形式的乳液的水相。

后加入适当的水溶性交联剂（如：戊二醛），交联后可形成球形颗粒PEI。

该颗粒可从油相分离并用于酶固定化（图3；Jordaan等人，2009年a）。

虽然胺基的密度非常高但是可阴离子蛋白相结合，它们也可用来作为二醛共价交联酶的基本结构。

高密度胺和开放性的网状结构可允许大于30％克/克的酶的含量。

除了交联粒子，吸附纤维也是一种选择。

将酶固定化在等电聚合物的纳米级纤维已被Wang等人在前几日研发（2009年）。

轮流使纤维结合官能团，并对酶加压，这样提高交联成功率（例如加入戊二醛），得到的酶集合吸附纤维（Kim等人，2008年）。

纳米技术是酶固定化的新兴技术，对于工业生物技术而言，固定化酶的纳米粒子可能难以处理，且要通过离心或过滤方法才能回收。

然而，磁性纳米粒子则相对容易回收（Betancor等人，2005；Prakasham等人，2007年）。

另一个有趣的概念是酶与聚合物连接后在将该物质与聚合物交联。

这将可用控制连接的长度。

Kim和Grate曾在2003年使用此概念，生成单一酶纳颗粒（SEN），后来被用来提供通过交联生产共价包封的酶。

多孔表面限制了长链极性分子如DNA、碳水化合物聚合物和蛋白质的聚合，因此Luarent等人在2008年研究出了目标物质的聚合受固体表面支撑力的影响且为正相关的结果。

Yu和Liang在2009年研发如何提高过氧化物酶的工作压力，采用了聚电解质（PE）的复合颗粒的可自组装的优点，构建三维胶体晶体阵列（CCA）和中空胶体晶体阵列（HCCA）具有非常大的表面区域。

类似方法在微反应器和微流体设备中的开发，以及酶在该反应器中的固定也是最近研发的热门课题。

（Krenkova和Foret，2004年）。

自固定化
如所提到的使用固体载体固定上述酶类可以减少特定容积的生物催化剂的活性10倍或更高。

无载体酶固定化可以使用带官能团的交联剂，例如戊二醛，结合酶彼此不需要固体载体的支持。

本身的物理性质更强大，因此通过交联生产的酶可与底物更加接近从而更容易催化底物反应，如蛋白晶体。

交联的酶晶体（CLEC；St.Clair和Navia，199年；如图4）被阿尔特斯生物公司商业化生产（Margolin，1996年）。

粒度大小多样化，从1微米到100微米都有，并具有较高的机械稳定性（部分稳定性的原因是本身就很稳定的晶体），并在有机溶剂中依然保持活性（Roy和Abraham，2004年）。

因为酶晶体中只含有一种酶，因此这种方法在工业生产保证了没有污染的出现。

不幸的是CLEC尽管广泛适用实验室中，但生产需要大量的高纯度蛋白质并且方法正在开发中，它仅适用于可结晶的酶。

该种晶体酶中只有一种酶。

尽管晶体酶的市场前景很好，但生产成本很高（Brady等人，2004年）。

然而，这仍然是一个值得研究的领域（Abraham和Bindhu，2009年），不久就会在在生物技术领域中会有更新的发展。

一个降低酶的生产成本的方法是提高酶与交联剂的结合的机会也就是说使蛋白质沉淀后与交联剂相结合从而生成一个直径50微米-100微米的小颗粒（Lopez-Serrano等人，2002；Kaul等人，2007年）。

这些交联酶集合体（CLEA）是在Sheldon的实验室进行研发的（Cao等人，2001；Sheldon等人，2005年；图4）并且开发了将其商品化的技术（荷兰）。

例如：固定腈水合酶（Kubac等人，2008）、脂肪酶（Lopez-Serrano等人，2002年），腈水解酶（Kaul等人，
2007年），青霉素酰化酶（Pchelintsev等人，2009年），氨基酰基转移酶（Bode 等人，2003年）和酶类（Sheldon，2007年b）。

通过细微的修饰交联反应的条件可以显著提升CLEA的特性。

交联剂（如戊二醛、戊二醛乙二胺聚合物、葡聚糖醛）可与一个结合后仍有较高活性的酶相交联（Kaul等人，2007）。

Pchelintsev等人在2009年发现在一定的时间里浓度梯度沉淀法观察CLEA与青霉素酰基转移酶交联后的微观结构以及酶活的变化。

Wilson等人在2009年发现，过量的交联剂会降低酶的转换产率，生产效率和稳定性。

同时Majumder等人在2008年还注意到，交联的程度影响酶的特异性。

多聚酶可以分离这将导致析出问题和活动与损失舰载固定作用靶点，也许，只有单体可被吸附。

Wilson等人在2004年证明多聚酶，如四聚体过氧化氢酶，被固定在CLEA上的方法可保持酶活，且可忽略由微小的温度变化导致的失活以及由少量的由表面活性剂（SDS）导致的变性。

在CLEA中加入PEI（作为交联剂）也显著地减少了由氧导致的氧敏感性酶的失活，如腈水解酶（Mateo等人，2006年）。

CLEAs要想更好的应用，可能还需要提升其物理理性质从而提高其刚性。

Wilson等人在2002年，为了提升CLEAs的刚性，将CLEAs包埋在Lentikats（聚乙烯醇水凝胶）中。

另外Lee等人在2005年，将用于内消旋细胞的，多孔的无旋性硅烷类的粒子用于固定酶，将酶固定在该种颗粒的表面空洞中，该反应在高压条件下进行，然后原位交联形成CLEAs。

该聚合体由于太大导致酶不能离开其对孔也不能通过过滤方法与反应介质分开(Kim等人，2008年）。

近日，一个以改变自固定化方法为目标的科研已取得了初步成功。

通过形成油包水的形式，将溶解酶和表面活性剂放在矿物油中，并加入双官能团交联剂，从而生成无载体的球型酶粒子（Spherezymes）（图3，图4）。

在此过程中脂酶有迁移至相边界的趋势且朝着疏水相面同时活性位点在油相中。

而酶随后在溶剂中交联形成永久性（该反应不可逆）的球形酶颗粒。

此法的发现，可提供高活性的脂酶，该没在水溶剂和有机溶剂中均能使用（Moolman等人，2005年；Brady等人，2007年）。

这方法也可广泛用于生产其它酶类和酶簇的固体颗粒，如：漆酶（Jordaan等人，2009年b，通讯作者）。

自发式自固定化
某些酶可自发形成大分子聚合物。

Sewell的实验室已经证实，一些腈水解酶可形成线性聚合物，该聚合体可比单一的酶更好回收（Thuku等人，2009年）。

另外巨大的蛋白质团可以用来充当其他酶的骨架。

Heyman等人在2007年开发一个卓越的技术，采用12.4 kDa的蛋白质（SP1）自发形成一个148.8 kDa的十二聚体环状化合物，该环状化合物可转化为一个大分子堆。

在葡萄糖氧化酶A基因框架中插入SP 1基因，表达所得蛋白将自我组装成多酶纳米颗粒，该结构中含有数百个葡萄糖氧化酶分子，Heyman等人在2007年随后提出更为复杂的融合12.4KDa的蛋白质分子（SP1）的技术。

将一个葡萄糖氧化酶的基因插入在SP1基因中表达出的蛋白质分子可自组装成一个有活性的酶簇粒子，该酶簇粒子中含
有上百个葡萄糖氧化酶分子。

Heyman等人在2007年下半年相继有提出了一个更为成熟的技术，是将黏连蛋白（cohesin蛋白）于SP1分子连接。

这将允他们连接来自于嗜热放线菌中的纤维素酶，该酶还可以与钩定蛋白（dockerin）相连接，这种近似于完美的系统中，几乎任何酶都可与钩定蛋白（dockerin）组成相应的结构。

这个系统可保证酶的高比活率。

另一种自组装固定化的方法涉及了纤维素簇结构域的使用。

通过其它基因与纤维素簇结构域的融合，也可用任意酶与纤维素结合，这种方法理论上是可能的，（用纤维素作为一种廉价的载体）。

Hwang等人在2004年使用来自嗜热脂肪芽孢杆菌的脂肪酶融合在纤维素簇结构域中并将其导入到木霉属的哈茨木霉的纤维素基因中。

基因融合后并被表达，该表达产物与脂酶活性蛋白质结合到Avicel （微晶纤维素）中。

类似的方法，Nahalka和Gemeiner在2006年将从梭菌属的食纤维梭菌（一种中温微生物）中提取纤维素簇域与来自于激烈热球菌（也可产甘油激酶、磷酸甘露糖变位酶和GCD甘露糖磷酸化酶）中的热稳定酶相融合。

这些酶可在中等温度（30℃-40℃）下与纤维素结合，但在80℃-90℃的情况下会分离。

因此这些酶在反应中可作为游离酶，但是反应后会被固定，因此容易从反应后的混合物中分离，带反应完成后直接冷却即可分离。

Ho等人在2008年用此方法在甲烷基异丁烯酸盐为催化剂的情况下，使酶自发的被多聚物外壳（甲基丙烯酸甲酯）包裹，在80℃的反应温度下形成纳米颗粒，这都归功于反应中的自由基。

新兴的固定化技术
增强性能
酶在有机溶剂中容易聚集在一起，因此与底物结合不充分。

而固定化酶可将酶在有机溶剂中的活性提升百倍（Khalaf等人，1996年；Sheldon，2007年a）。

高密度的酶可通过固定化的方法来实现其优势。

Heyman等人在2007年下半年认为纤维素酶的高密度固定化带来的纤维素酶具有高效活性的的特点可能属于酶和底物的协同效应。

底物反应前的超活化已被人们重视。

脂肪酶有两种构型：开放和封闭（Aloulou 等人，2006年；Palomo，2008年）。

开放式的脂肪酶更为活跃它可诱导活化反应在疏水相和亲水相的交相面。

封闭式的脂肪酶在开放式的脂肪酶可在有载体的情况下可完成固定化（Mateo等人，2007年下半年），该载体可用CLEA （Lopez-Serrano等人，2002年；Sheldon，2007年下半年）和球状酶系（Spherezymes）（Brady等人，2008年）。

由于分子生物学的进步，现在也可对酶进行修饰（通过定向诱导或直接诱变）以提高固定化能力，例如：一种可连接附加残基的载体（Mateo等人，2007年c）或是改变一个特定的载体（Ansorge-Schumacher等人，2006年）。

改进底物的选择性
定向固定化涉及到的可选择的结合位点是通过特异性作用使酶与载体上的官能团相接合。

通过增加酶结构方面的认知。

可提升酶的定向选择性甚至是酶活（Palomo，2008年）。

调节酶与底物的选择性，也可减少酶的抑制作用，从而通
过改进底物的选择性来实现的固定化新技术（Mateo等人，2007年b）。

底物的印记（指基因和染色体保留其配子的某些特征进行选择性差异表达）可以修饰底物使其优先选择固定化酶（这个过程称作交联印记法或CLIP法）。

Kaulpiboon等人在2007年，使底物与环化糊精糖基转移酶在固定化的僵化期的结构相对固定。

从而提高了酶的合成能力与其水解活性。

特别是，在生物工艺学中重要的是酶的选择性调节，因为结构为单一对应体的化合物只占普通药物分子的54% ，然而我们需要将其纯度提高到99.5%以上（Ran等人，2008年）。

尤其是，还想进一步尝试基因工程药物（May等人，2000年）。

然而，改进该技术，一个理想的方法就是通过酶的固定化技术（Palomo，2008年）。

Cabrera等人在2009年证明了CaL-B脂肪酶的四级结构的专一性对于水解外消旋的2-O-丁酰基-2-苯基乙酸不管是从数量上（对应体过量的百分数，对映体过量的简称为：ee）还是质量上（R型或S型的总产物）都有良好的表现，酶的构型可进行转化（如：R型转化为S型），在99%的对应体过量的情况下在羧酸阳离子交换树脂中可转化为R型转化率为95%，该反应在辛基琼脂糖中进行。

虽然脂肪酶的对应体转化实验取得了大量的成功，但是Wang等人2008年也发现了用产气克雷伯氏菌脂酶生产时即便将其固定在Eupergit C （250 L）还是出现了大量R型和S型扁桃酸乙酯的对应体。

最后想要叙述的是，酶最适pH和温度可能会因为被固定化而导致有所变化。

改良的热稳定性固定化酶通常在温度升高后依然能有良好的功能。

正如所看到的固定化后的酶的最适PH值可能变化不是很大，但是在微环境中酶功能上的变化还是能看出来的（Cabrera等，2009年）。

多级反应和选择性生物安全隔离区
固定化酶也可以进行酶簇反应，且在人工代谢途径和化学-酶途径中的个别催化剂的生物安全隔离区域内连级反应（Sheldon，2007年a）。

举个例子Brazeau等人在2008年已经开发出一种固定化酶的酶簇反应的通路，将其固定在Eupergit C 上，用于合成的莫纳汀。

偶联酶系统的联合固定化可提高其生物活性（Betancor 等人，2006年），例如：将硝基苯硝基还原酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶联合包埋在二氧化硅粒子中，其中，G6PD（G6PD是一种存在于人体红血球内，协助葡萄糖进行新陈代谢的酵素）是允许再生NADPH（还原性辅酶II）的。

St. Clair等人在2000年也表明了在氧化还原反应中CLEC也能保留辅因子。

酶在选择性生物安全隔离区内进行固定化和保证其优点。

V an Dongen等人在2009年使用共聚合物异氰酸盐小肽和苯乙烯生成具有多孔的聚合物，并将叠氮基衍生物辣根过氧化物酶固定在其生成的薄膜表面，疏水的CAL-B位于双层膜中，并将亲水性葡萄糖氧化酶固定早聚合物囊泡腔中。

这三种酶可可演示并证明一个以葡萄糖乙酸（由脂肪酶和氧化由葡萄糖氧化酶脱乙酰化）为底物的三步连续酶簇反应，并产出一个过氧化物，这个过氧化物随后被过氧化物酶氧化后生成ABTS[2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐]。

类似用与生物安全隔离区中的反应和多种酶（漆和脂肪酶）的Spherezymes（一种新颖的结构化自固定化酶的技术）反应（Brady等人，2008年）。

结论。