MicroRNA-100对肝癌细胞增殖活力和细胞周期的影响

MicroRNA-100对肝癌细胞增殖活力和细胞周期的影响嵇晓辉;范秉琳;张红鸽;蔡新华;朱武凌
【摘要】AIM: To investigate the effect of microRNA-100 (miR-100) on the proliferation activity and cell cycle of hepatocarcinoma cells. METHODS; Synthetic miR-100 mimic and its negative control were transfected into human hepatocarcinoma HepG2 cells by liposome method. After transfection, the cell counting kit-8 (CCK-8) was used to measure the cell proliferation activity. The cell cycle distribution was determined by flow cytometry. The expression of Polo-like kinase 1 ( Plk1) at mRNA and protein levels was detected by quantitative real-time PCR ( qRT-PCR) and Western blotting. RESULTS: The transfection efficiency mediated by cationic liposome was greater than 85%. The inhibitory rates of cell prolifer ation in HepG2 cells were (43. 5 ±12.2)%, (46.5±3.7)% and (52.1
±0.2)% at 24 h, 48 h and 72 h after transfected with miR-100 mimic, respectively, which were significantly increased as compared with the control cells. Moreover, the cell proliferation index in experimental group (35. 8 ± 1.4) was higher than that in negative control group (39.2 ± 1.0) and simple liposome group (40.7 ± 2.0) at 72 h. At the same time, the mRNA and protein expression levels of Plkl obviously decreased in HepG2 cells transfected with miR-100 at 72 h after transfection. CONCLUSION: miR-100 suppresses the proliferation activity of hepatocarcinoma cells by down-regulating Plk1 gene expression.%目的:探讨microRNA-100(miR-100)对肝癌细胞增殖活力和细胞周期的影响及其可能机制.方法:通过脂质体介导将人工
合成的miR-100模拟物及其阴性对照转染人肝癌HepG2细胞,用细胞计数试剂盒8(CCK-8)方法检测转染后HepG2细胞的增殖活力,用流式细胞术判定细胞周期分布,并进一步用实时荧光定量RT-PCR和Western blotting分析Polo样激酶
1(Plk1)的表达水平.结果:荧光显微镜下观察到经阳离子脂质体介导的细胞转染效率大于85％.转染miR-100模拟物的实验组细胞的增殖抑制率在24、48和72 h分别为(43.5±12.2)％、(46.5±3.7)％和(52.1±0.2)％,均显著高于对照组细胞(P＜0.01),并且在72 h实验组细胞增殖指数(35.8±1.4)低于阴性对照组(39.2±1.0)和单纯脂质体组(40.7±2.0)(P＜0.05).同时与对照组相比,实验组细胞Plk1 mRNA和蛋白表达水平在转染miR-100后72 h明显降低(P＜0.05).结论:miR-100可抑制肝癌细胞增殖,其机制可能与其下调Plk1的表达有关.
【期刊名称】《中国病理生理杂志》
【年(卷),期】2013(000)001
【总页数】4页(P108-111)
【关键词】肝肿瘤;MicroRNA-100;Polo样激酶1
【作者】嵇晓辉;范秉琳;张红鸽;蔡新华;朱武凌
【作者单位】新乡医学院基础医学院,河南新乡453003;新乡医学院基础医学院,河南新乡453003;新乡医学院基础医学院,河南新乡453003;新乡医学院基础医学院,河南新乡453003;新乡医学院基础医学院,河南新乡453003
【正文语种】中文
【中图分类】R329.28
MicroRNAs(miRNAs)是一类短小(20～24 nt)的非编码RNA，通过影响mRNA 的稳定性和翻译而参与多细胞生物体中基因表达的转录后调控。

MicroRNA-
100(miR-100)在人类定位于 11q24.1，研究表明它在鼻咽癌、卵巢癌、宫颈癌等多种肿瘤中异常表达，失去对靶基因Polo样激酶1(Polo-like kinase 1，Plk1)的调控，因而Plk1表达上调，这种改变不仅参与癌的发生过程，而且可能与肿瘤的进展密切相关［1-3］。

目前尚不十分清楚miR-100对肝癌细胞的生物学作用及其分子机制，本实验采用阳离子脂质体Oligofectamine介导，将人工化学合成的miR-100模拟物瞬时转染人肝癌HepG2细胞中，分析肝癌细胞的增殖活力、细胞周期和Plk1的表达情况，以期能够揭示miR-100对肝癌细胞的作用与机制。

材料和方法
1 细胞培养
人肝癌细胞株HepG2用含10%胎牛血清及1×105U/L青霉素、100 mg/L链霉素的DMEM培养液，置37℃、5%CO2培养箱培养，选用对数生长期细胞进行转染实验。

2 miRNA-100的合成及实验分组
根据 miR-100的核苷酸序列:5'-AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG-3'，由大连宝生物公司合成带有荧光素Cy3标记的miRNA-100模拟物以及阴性对照，同时实验附设单纯脂质体对照。

3 细胞转染
按照阳离子脂质体Oligofectamine试剂(Invitrogen)的操作说明进行，将85 μL 培养液Opti-MEM与20 μmol/L miR-100模拟物和阴性对照各5 μL充分混和，与脂质体/Opti-MEM混合物再次混合，将最终混合物加入含新鲜Opti-MEM培养基的肝癌HepG2细胞中，转染终浓度为100 nmol/L，在37℃、5%CO2培养
箱中继续培养至24 h、48 h和72 h。

4 细胞增殖抑制率测定
细胞培养于96孔板中，5×103cells/well，培养24 h后进行转染，转染后24 h、48 h及72 h，加入细胞计数试剂盒8(cell counting kit-8，CCK-8)溶液10 μL后继续培养3 h，酶标仪检测波长450 nm处各孔吸光度(A)。

细胞生长抑制率(%)=(1－实验孔A值/对照孔A值)×100% 。

5 流式细胞术分析
于4℃、75%乙醇中固定收集细胞8 h。

离心后将细胞重新悬浮于含有200 mg/L RNA酶及15 mg/L碘化丙啶的PBS中，室温孵育30 min后，通过流式细胞仪(Beckman Coulter)进行细胞周期分析，检测重复3次。

细胞增殖指数的计算方法为:(S+G2/M)÷(G0/G1+S+G2/M)。

6 实时荧光定量RT-PCR检测
采用 Trizol试剂(Invitrogen)提取实验各组HepG2细胞的总RNA，紫外检测仪分别在260 nm和280 nm波长下检测RNA的浓度及纯度。

用逆转录试剂盒(TaKaRa)合成cDNA，以此为模板进行实时荧光定量PCR扩增。

Plk1上游引物
5'-CCTCTCACAGTCCTTAATAA-3'，下游引物5'-TGTCCGAATAGTCTACCC-3'。

实验同步以β-actin作为内参照，上游引物5'-CCAAGGCCAACCGCGAGAAGATGAC-3'，下游引物 5'-AGGGTACATGGTGGTGCCGCCAGAC-3'。

mRNA表达量的分析采用比较Ct数
据法(2－ΔΔCt)进行。

每组实验重复3次。

7 Western blotting分析
按蛋白提取试剂盒(Thermo)说明书进行并测定浓度，取60 μg蛋白进行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳完成后将蛋白转至PVDF膜。

封闭、抗体孵育及显色按照One-Step Western试剂盒(GenScript)说明进行，Plk1Ⅰ抗(Abcom)工作浓度为
1∶600，结果采用Quantity One凝胶图像处理软件进行分析。

8 统计学处理
采用SPSS 17.0软件包进行分析。

数据以均数±标准差(mean±SD)表示，采用t
检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果
1 肝癌细胞转染
人工合成Cy3荧光标记的miR-100模拟物转染HepG2细胞，培养24 h后在激
光共聚焦显微镜下观察，可见大部分细胞内有红色荧光，见图1，转染效率大于85%。

Figure 1.HepG2 cells transfected by miR-100 mimic(labeled with Cy3 fluorescent dye).图1 Cy3荧光标记的miR-100模拟物转染HepG2细胞
2 肝癌细胞增殖活力
用CCK-8法分析转染后24 h、48 h和72 h的细胞增殖活力，测得实验组和对照组细胞450 nm波长处各孔A值，计算出细胞增殖抑制率，见表1。

同对照组细
胞相比，实验组细胞在miR-100转染后各时点的增殖抑制率均显著升高(P＜0.01)。

表1 HepG2细胞转染后各检测时点细胞增殖抑制率Table 1.Inhibitory rate of cell proliferation in transfected HepG2 cells(%.Mean±SD.n=3)＊＊P ＜ 0.01 vs liposome or negative control.Group 24 h 48 h 72 h Liposome 20.6 ±5.3 16.6 ±4.2 13.6 ±0.2 Negative control 21.3 ±10.1 17.3 ±0.9 15.9 ±0.1 miR-100 43.5 ±12.2＊＊46.5 ±3.7＊＊52.1 ±0.2＊＊
3 细胞周期分析
流式细胞术检测结果显示，实验组细胞在转染后72 h G0/G1、S和G2/M期细胞分布发生了改变，S期和G2/M期细胞比例下降，其细胞增殖指数(35.8±1.4)较阴性对照组(39.2 ±1.0)和单纯脂质体组(40.7 ±2.0)减小 (P ＜0.05)。

4 Plk1表达情况
通过qRT-PCR检测和Western blotting相对灰度值分析，在转染后72 h miR-100实验组癌细胞Plk1 mRNA表达水平较各对照组降低，见图2，同样Plk1蛋
白表达也明显减少，见图3。

Figure 2.Plk1 mRNA expression in HepG2 cells 72 h after
transfection.HepG2 cells were transfected with miR-100 minic for 72 h.Plk1 mRNA expression was determined by real-time RT-PCR.Mean ±SD.n=3.＊
＊P ＜0.01 vs blank control，liposome or negative control.图2 HepG2细胞经转染后72 h Plk1 mRNA的表达分析
讨论
肝癌在我国是最常见的恶性肿瘤之一，每年因肝癌死亡约11万人，占全球肝癌死亡总数的45%，严重威胁着人民群众的身体健康。

目前在临床上主要有外科切除、化疗、TACE等治疗，尽管它们能延长部分患者的生存时间，但是都不能取得满意的结果。

随着在分子水平上对肝癌研究的不断进展，基因治疗成为临床应用前景最为看好的靶向治疗，寻找基于新机制的治疗手段一直是国内外研究的热点［4-5］。

Figure 3.Plk1 protein expression in HepG2 cells 72 h after
transfection.HepG2 cells were transfented with miR-100 minics for 72 h，Plk1 protein was determined by Western blotting assay.A:blank
control;B:liposome;C:negative control;D:miR-100.Mean ± SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs A，B or C.图3 HepG2细胞经转染后72 h Plk1蛋白表达分析
近年来研究表明，miRNAs在肝细胞癌中表达异常，导致癌基因的激活上调和抑
癌基因的功能缺失，从而调控癌细胞增殖和肿瘤生长［6-7］。

Li等［8］分析发
现在HepG2细胞中miR-224高表达对细胞增殖、分化及转移产生影响，但细胞
周期并无明显变化。

在本研究中，我们以阳离子脂质体Oligofectamine为介导，
用人工合成的miR-100寡聚核苷酸瞬时转染人肝癌HepG2细胞，旨在揭示miR-100对肝癌细胞的生物学作用。

经CCK-8方法检测发现，miR-100实验组在转染后24 h、48 h和72 h的细胞增殖抑制率较其它各对照组均有显著上升，说明肝
癌细胞的增殖活力受到miR-100的影响而减低。

同时流式细胞术分析结果显示，miR-100实验组的细胞周期分布在转染后72h发生改变，处于S期和G2/M期的细胞比例下降，细胞增殖指数减小，说明miR-100的转染引起了肝癌细胞的细胞周期变化。

由此可见miR-100参与肝癌细胞的增殖和细胞周期调控。

Plk1是一种有丝分裂调控蛋白，在有丝分裂进展中起到十分重要的作用，其高表
达会促进染色体不稳定和非整倍体产生。

现已证实Plk1在许多癌症中异常表达，
通过shRNA或化学抑制剂阻断Plk1的表达或降低其激酶活性，无论是在体外和
体内都可以有效遏制细胞增殖和肿瘤生长，更有意义的是，这种抑制作用可优先杀死癌细胞，而对于正常细胞并无大碍［9-12］，因此Plk1成为一个理想的肿瘤基因治疗新靶点。

本实验针对Plk1受miR-100调控，运用转染技术成功建立miRNA干扰模型，经qRT-PCR和Western blotting的检测分析，结果表明
miR-100寡核苷酸转染抑制了Plk1基因的表达，势必影响细胞有丝分裂，从而对癌细胞的增殖产生阻滞作用，这为进一步探索肝癌的靶向治疗提供了新的途径。

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