基因工程习题+答案

第一章绪论
名词解释：
1.基因操作：将在细胞外产生的核酸（物质）分子插入到病毒，质粒或其它载体系统中，再整合到特定的宿主中，从而形成一种新的可连续繁殖的有机体。

2.间断基因：序列中间插入有与氨基酸编码无关的DNA间隔区，使一个基因分隔成不连续的若干区段。

我们称这种编码序列不连续的基因为间断基因。

3.启动子：DNA分子可以与RNA聚合酶特异结合的部位，也就是使转录开始的部位。

4.亚克隆：当初始克隆中的外源DNA片段较长，含有许多目的基因以外的DNA片段时，在诸如表达、序列分析和突变等操作中不便进行，将目的基因所对应的一小段DNA找出来，这个过程叫“亚克隆”。

填空题：
1.基因操作的核心部分是基因克隆，基因克隆的基本要点有（克隆基因的类型），（受体的选择）和（载体的选择）。

2.（基因）是遗传物质的基本单位,也是作为遗传物质的核酸分子上的一段片段。

它可以是连续的，也可以是（不连续的）；可以是（DNA），也可以是RNA；可以存在于染色体上，也可以（存在于染色体之外如质粒、噬菌体）。

3.基因操作并不是一个法律概念，除了包括基因克隆外，还包括基因的（表达）、（调控）、（检测）和（改造）等与基因研究相关的内容。

4.启动子是指（基因转录过程中控制起始的部位）。

通常一个基因是否表达，（转录起始）是关键的一步，是起决定作用的。

在转录过程中，启动子还是（RNA聚合酶）的结合位点。

5.原核生物的RNA聚合酶主要由两部分组成：（核心酶）和（σ因子），其中σ-因子并不参与RNA的合成，它的作用主要是（识别要转录的起始位点）。

6.从（启动区）到（终止区）的这一段距离称为一个转录单位，或者一个转录产物，其中可包括一个或者多个基因。

7.转录终止子主要有两种，一种是（依赖ρ因子），另一种是（不依赖ρ因子）。

8.基因的书写方式，通常是写出的DNA序列总是与（mRNA）相同的那条链，方向是从（5'）到（3'）。

对于碱基的位置，一般自转录起始点向两个方向编号，其中转录起始点定为（+1），（在起始点上游第一个碱基）定为-1。

9.重叠基因是指（一个基因的序列中，单个DNA序列可编码一个以上的蛋白质），间隔基因是指（在编码序列中间插入的一段无编码作用的碱基序列）
简答题：
1.简述基因克隆的两个基本特征？
基因克隆的两个基本特征是一是强调外源核酸分子（一般情况下都是DNA）在不同宿主中的繁殖，打破自然种的界限将来自于不相关物种的基因放入一个宿主中是基因操作的一个重要特征，基因操作的另一个重要特征是繁殖。

2.谈谈你对基因的认识，并简要说说基因概念的发展情况？
能够表达和产生基因产物的DNA序列（可自由发挥，发展情况请查找相关资料）基因概念的发展：基因作为遗传学中的专用术语，其概念每发展一步都意味着遗传学乃至整个生物学的一次革命和突破，其内容的每次丰富和充实都凝聚着生物学家们的滴滴心血。

“基因”概念的提出：遗传学的奠基人孟德尔在1866年发表的论文《植物杂交试验》指出生物每一个性状都是通过遗传因子来传递的，遗传因子是一些独立的遗传单位。

这样把可观察的遗传性状和控制它的内在的遗传因子区分开来了，遗传因子作为基因的雏形名词诞生了。

1909年丹麦遗传学家约翰逊在《精密遗传学原理》一书中提出“基因”概念，以此来替代孟德尔假定的“遗传因子”。

从此，能够表达和产生基因产物（protein or RNA）的DNA序列（可自由发挥）“基因”一词一直伴随着遗传学发展至今。

基因结构和功能的探索：摩尔根和他的学生们利用果蝇作了大量的潜心研究，1926年他的巨著《基因论》出版，从而建立了著名的基因学说，首次完成了当时最新的基因概念的描述，即基因以直线形式排列，它决定着一个特定的性状，而且能发生突变并随着染色体同源节段的互换而交换，它不仅是决定性状的功能单位，而且是一个突变单位和交换单位。

1941年比德尔和塔特姆提出一个基因一个酶说；1949年鲍林与合作者在研究镰刀型细胞贫血症时推论基因决定着多肽链的氨基酸顺序；1944年艾弗里、麦卡蒂首次用实验明确证实：DNA是遗传信息的载体；1952年赫尔希和蔡斯进一步证明遗传物质是DNA而不是蛋白质；1953年美国分子生物学家沃森和英国分子生物学家克里克通力协作，根据X射线衍射分析，提出了著名的DNA双螺旋结构模型，进一步说明基因成分就是DNA，它控制着蛋白质的合成；1957年法国遗传学家本滋尔以T4噬菌体作为研究材料分析了基因内部的精细结构，提出了顺反子学说。

这个学说打破了过去关于基因是突变、重组、决定遗传性状的“三位一体”概念及基因是最小的不可分割的遗传单位的观点，从而认为基因为DNA分子上一段核苷酸序列，负责着遗传信息的传递，一个基因内部仍可划分为若干个起作用的小单位，即可区分成顺反子、突变子和重组子。

一个作用子通常决定一种多肽链合成，一个基因包含一个或几个作用子。

突变子指基因内突变的最小单位，而重组子为最小的重组合单位，只包含一对核苷酸。

所有这些均是基因概念的伟大突破。

关于基因的本质确定后，人们又把研究视线转移到基因传递遗传信息的过程上。

1961年开始，尼伦伯格和科拉纳等人逐步搞清了基因以核苷酸三联为一组编码氨基酸，并在1967年破译了全部64个遗传密码，这样把核酸密码和蛋白质合成联系起来。

然后，沃森和克里克等人提出的“中心法则”更加明确地揭示了生命活动的基本过程。

1970年特明以在劳斯肉瘤病毒内发现逆转录酶这一成就进步发展和完善了“中心法则”，至此，遗传信息传递的过程已较清晰地展示在人们的眼前。

过去人们对基因的功能理解是单一的即作为蛋白质合成的模板。

1961年法国雅各布和莫诺的研究成果，又大大扩大了人们关于基因功能的视野。

他们在研究大肠杆菌乳糖代谢的调节机制中发现了有些基因不起合成蛋白质模板作用，只起调节或操纵作用，提出了操纵子学说。

从此根据基因功能把基因分为结构基因、调节基因和操纵基因。

基因概念的进一步发展：70年代后，基因的概念随着多学科渗透和实验手段日新月异又有突飞猛进的发展，主要有以下几个方面。

基因具重叠性、内含子和外显子、管家基因与奢侈基因和基因的游动性。

所有这些成果无疑给基因概念中注入鲜活科学的内容，帮助人们揭开层层面纱去更加全面了解基因的真面目。

时代在发展，科学在进步，基因概念的深入发展，必将对人类的文明进步产生强大的推动作用。

3.如何理解基因及其产物的共线性和非共线性？
基因决定蛋白质的序列组成，是由密码子对应特定氨基酸所决定的。

当一个基因的核苷酸序列与其产物的氨基酸序列是一一对应时，则表明它们是共线性的。

在原核生物中，基因及其产物是共线性的。

70年代以来，在真核生物中，发现了间断基因，后来发现这种间断基因在真核生物中普遍存在，也就是后来所说的基因间存在着内含子。

内含子指真核生物基因中不能被翻译成蛋白质的DNA片断，但可被转录，当两侧序列的转录RNA被剪接在一起时，就将内含子转录的RNA从整个转录物中除去。

外显子是指能够翻译成蛋白质的任一间断的基因片段，一个基因可有多个外显子。

内含子并不是一成不变的，具有相对性，对一个DNA片断来说，在某个基因中是内含子，但在另一个基因中却可以作为外显子。

4.什么是基因克隆？什么是亚克隆？
基因克隆：一定程度上等同于基因的分离，即从复杂的生物体基因组中，经过酶切，消化等步骤，分离带有目的基因的DNA片段。

基因亚克隆：初步克隆中的外源片段往往较长，含有许多目的基因片段以外的DNA片段，在诸如表达、序列分析和突变等操作中不便进行，因此必须将目的基因所对应的一小段DNA找出来，这个过程叫“亚克隆”。

5.假如从一个原核生物中cloning某基因（1-2kb），请谈谈它的基本步骤？
①对原核生物染色体DNA进行不完全酶切，纯化所得到的DNA片断，并与载体连接，转化大肠杆菌；②得到转化子后，根据目标基因两侧的已知序列设计探针，杂交，筛选转化子；③所得到的转化子中含有目标基因，进一步作亚克隆，一步步地向目标基因逼近，最后可得到目标基因
6.什么叫基因工程，试从理论和技术两个方面谈谈基因工程诞生的基础？
基因工程又称基因操作、重组DNA。

基因工程是以分子遗传学理论为基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因（DNA分子），按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原先的遗传特性，获得新品种，生产新产品，或是研究基因的结构和功能。

7.简述基因操作、基因重组和基因工程的关系。

8.为什么说基因工程是生物学和遗传学发展的必然产物？
9.简述基因的结构组成对基因操作的影响。

第二章分子克隆工具酶
名词解释
1.限制和修饰：宿主特异性地降解外源遗传物质（DNA）的现象称为限制。

外源遗传物质通过甲基化等作用避免宿主的限制作用称为修饰。

2.匹配末端：识别位点为回文对称结构的序列，经限制酶切割后，产生的相同的，互补的末端称为匹配粘端，亦即粘性末端（cohesive end）。

3.平末端：在回文对称轴上同时切割DNA的两条链，产生的没有碱基突出的末端称为平末端。

4.同裂酶：识别相同序列的限制酶称同裂酶，但它们的切割位点可能不同。

5.同尾酶：来源不同、识别序列不同，•但产生相同粘性末端的酶。

6.位点偏爱：某些限制酶对同一介质中的不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称为位点偏爱。

7.星星活性：在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。

8.切口酶：有些限制酶只切割双链DNA中的一条链，产生单链缺口，这种酶称为切口酶。

9.Klenow片段：Klenow DNA聚合酶是E.coli DNA polymerase经蛋白酶（枯草杆菌蛋白酶）裂解而从全酶中除去5'--3'外切活性的多肽大片段，而聚合活性和3'--5'外切活性不受影响。

10.反转录酶：即依赖于RNA的DNA聚合酶，它有5'--3'合成DNA活性，但是无3'--5'外切活性。

它来自AMV（禽成髓细胞瘤病毒）或Mo-MLV（Moloney鼠白血病病毒，又称M-MuLV）。

11.末端转移酶：来源于小牛胸腺，是存在于前淋巴细胞及分化早期的类淋巴样细胞内的一种不寻常的DNA聚合酶，在二价阳离子存在下，末端转移酶催化dNTP加于DNA分子的3'羟基端。

若dNTP为T或C，此二价阳离子首选钴离子；若dNTP为A或G，此二价阳离子首选镁离子。

12.连接酶：催化DNA 5'磷酸基与3'羟基之间形成磷酸二酯键，将两段核酸连接起来的酶。

13.T4多核苷酸激酶：催化ATP的γ-磷酸基转移至DNA或RNA的5'末端。

14.碱性磷酸酶：主要来源于牛小肠（Calf intestinal alkaline phosphatase），简称CIP 或CIAP，也有来自细菌（BAP）。

催化除去DNA或RNA 5'磷酸。

15.Sl核酸酶。

来源于米曲霉（Aspergillus oryzae），可降解单链DNA或RNA，产生带5'磷酸的单核苷酸或寡核苷酸双链；对dsDNA，dsRNA，DNA:RNA杂交体不敏感。

16.外切核酸酶Щ：来源于大肠杆菌，催化从dsDNA 3'-OH逐一去除单核苷酸的反应，底物为dsDNA或线状和带切口或缺口的环状DNA，反应结果是在dsDNA上产生长的单链区。

17.单链结合蛋白：此蛋白能协同地与ssDNA结合而不与dsDNA结合，可以削弱链内二级结构的稳定性，从而加速互补多核苷酸的重新退火，并通过消除阻碍DNA聚合酶前进的链内二级结构，而提高这些聚合酶的持续作用能力。

18.蛋白酶K：是具有高活性的丝氨酸蛋白酶，属枯草杆菌蛋白酶，可以水解范围广泛的肽键，尤其适合水解羧基末端至芳香族氨基酸和中性氨基酸之间的肽键。

K指该蛋白酶通过水解角蛋白（keratin）可以为该霉菌提供所有所需的碳源和氮源。

19溶菌酶：一类水解细菌细胞壁中肽聚糖的酶，常用的是卵清溶菌酶，用于破碎细胞。

填空题：
1.Ecok的一般分子组成为R2M2S，在这些亚基中，R亚基具有（限制酶）的作用，M亚基具有（甲基化）的作用，S亚基具有（识别DNA序列）的作用，当该该酶发生作用时，需用到的辅因子有：（ATP）、（SAM）、（Mg2+）。

2.限制性内切核酸酶（Restriction endonuclease）的命名是按属名和种名相结合的原则的，通常第一个大写字母取自（属名的第一个字母），第二、三个字母取自（种名的前两个字母），第四个字母则用（菌株名）表示。

3.Ⅱ型限制酶识别回文对称序列，在回文序列（内部）或（附近）切割DNA，产生带3'－OH 和5'－P基团的DNA的产物，需（Mg2+）的存在才能发挥活性，相应的修饰酶只需SAM。

4.从因特网上可以找到限制酶的数据库（REBASE），该网站由New England Biolabs公司维护（）。

5.识别相同序列的限制酶称（同裂酶）。

6.Ⅰ-CeuI酶是衣滴虫叶绿体大rRNA基因的内含子编码的产物，识别位点为（26）bp，识别的核心部位为（-12）至（+7）位置的19bp，反应温度为37℃。

7.位点偏爱是指：（限制酶对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率）。

8.1单位NaeⅠ或NarⅠ的定义：（切割1μg腺病毒2 DNA在50ul体系中1小时所需的酶量）
9.有些限制酶只切割双链DNA中的一条链，产生单链缺口，即（切口酶）
10.个体间DNA限制性片段长度的差异叫（限制性片段长度多态性）
11.DNA载体经HindⅢ切割后产生粘性末端，能发生载体自连，影响载体与外源DNA的连接效率，常用的防止载体自连的方法有（去磷酸化）、（部分补平）。

12.完全的回文序列应具备两个特点即（能够在中间划一个对称轴，两侧的序列两两对称互补配对）和（两条互补链的5'--3'的序列组成相同，即将一条链旋转180°，则两条链重叠）。

13.Dcm Methylase（Dcm甲基化酶）的识别序列为（CCTGG）和（CCAGG），该酶的作用位点为（第二个胞嘧啶C的C5位置）。

14.大肠杆菌中至少有三种依赖于甲基化的限制系统（mcrA）、（mcrBC）、（mrr）。

它们识别的序列各不相同，但只识别经过甲基化的序列，都限制CpG甲基化酶作用的DNA。

15.分别写出以下限制性内切核酸酶（Restriction endonuclease）的识别序列EcoRⅠ（GAATTC）、Sau3AⅠ（GATC）、HindⅢ（AAGCT）。

16.Weiss单位的定义为（在37℃下20分钟内催化1nmol32P从焦磷酸根置换到[γ,β－32P]ATP所需的酶量）
17.限制性内切核酸酶（Restriction endonuclease）通常保存在（50%）浓度的甘油溶液中。

18.载体和外源DNA经酶切，在进行下一步操作前，需消除限制性内切核酸酶（Restriction endonuclease）的影响。

常用的方法有（EDTA法）、（加热法）、（苯酚抽提法）、（试剂盒除酶法）。

19.对DNA进行双酶切时，酶切缓冲液的选择原则有(1)（可选用都合适的缓冲液或通用缓冲液）、(2)（若缓冲液不可替代则先用低浓度的，再加适量NaCl和第二种酶）、(3)（先用低盐缓冲液再用高盐缓冲液）
20.DnaseⅠ为内切核酸酶，在不同的辅因子条件下，产生不同的酶切效果，当Mg2+存在时（独立作用于每条DNA链，且切割位点随机）；当Mn2+存在时（可在两条链的大致同一位置切割dsDNA，产生平端或1到2个核甘酸突出的DNA片断）。

21.Klenow DNA聚合酶是E.coli DNA polymerase经蛋白酶裂解而从全酶中除去（5'--3'的外切活性）活性的多肽大片断，而其他活性保持不变。

22.T4 phage DNA polymerase分子量为（114）kDa，该酶的3'--5'的外切活性比Klenow 酶强（200）倍，由于它不从单链DNA模板上替换引物，故可用于（提高诱变反应）。

23.反转录酶来自AMV或Mo－MLV，即依赖于RNA的DNA聚合酶，它有（5'--3'合成DNA的）活性，但无（3'--5'的外切）活性。

24.末端转移酶来源于（小牛胸腺），是存在于前淋巴细胞及分化早期的类淋巴样细胞内的一种不寻常的DNA聚合酶，在（Mg2+）存在下，末端转移酶催化dNTP加于DNA分子的3'羟基端。

25.T4 DNA连接酶的分子量为68kDa，它可以催化DNA 5'磷酸基与3'羟基之间形成磷酸二酯键。

反应底物为粘端、切口、平端的RNA或DNA。

低浓度（聚乙二醇PEG）和（单价阳离子）可以提高平端连接效率。

26.E.coli DNA连接酶与T4 DNA连接酶相似，但需（烟酰胺－腺嘌呤二核苷酸）的参与，且其平端连接效率低常用于置换合成法。

27.T4多核苷酸激酶在高浓度的ATP时发挥最佳活性，（NH4+）是其强烈抑制剂。

28.BAL31核酸酶主要活性为3'外切核酸酶活性，可从线性DNA两条链的3'端去除掉单核苷酸；还可从内部切割核酸，作用于单链。

BAL31发生作用依赖（Ca2+），（EGTA）可抑制其活性。

29.绿豆核酸酶来源于绿豆芽，与S1酶相似，但比S1酶更温和，在（大切口）上才切割，可使DNA突出端变成平端。

30.核糖核酸酶A来源于牛胰，为内切核酸酶，可特异攻击（RNA上嘧啶残基的3'端）。

可除去DNA:RNA中未杂交的RNA区，可用来确定DNA或RNA中单碱基突变的位置。

31.用于构建嵌套缺失体常用到的核酸酶有（DnaseⅠ）、（外切核酸酶Ⅲ）、（BAL31）。

32.琼脂糖酶作用于低熔点琼脂糖，它的活性是可切割琼脂糖酶亚单位。

由于此酶可分解琼脂糖，因此应用于（分离大片段DNA）。

简答题：
1.简述限制性内切核酸酶（Restriction endonuclease）的概念及其生物学功能？
定义：指识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。

生物学功能：保护宿主不受外来DNA分子的感染，可降解外来的DNA分子，从而阻止其复制和整合到细胞中。

2.PCR引物设计引入酶切位点时，为什么需在酶切位点后加上一些碱基？
限制酶切割DNA时对识别序列两端的非识别序列有长度要求，也就是说在识别序列两端必须要有一定数量的核苷酸，否则限制酶将难以发挥切割活性。

因此，一般需在设计引物时在限制酶切位点外另加3～4个碱基。

3.试回答影响限制性内切核酸酶（Restriction endonuclease）切割效率的因素？
外因：反应条件、底物纯度、反应温度和限制性内切酶本身的活性；内因：位点偏爱性；甲基化；底物的构象。

4.在酶切缓冲液中，一般需加入BSA，请问加入BSA的作用是什么？并简述其原理？
作用是提供一定的蛋白质浓度，起保护限制性内切酶的作用。

限制性内切酶在稀释液中会迅速变性，BSA是一种很好的可加入酶反应液中的中性蛋白质。

5.何谓Star activity？简述Star activity的影响因素及克服方法？
在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特征称为星星活性。

引起星星活性的的因素：①高甘油浓度（>5%）；②酶过量（>100U/ml）；③低离子强度（<25mM）；
④高pH(>8.0)；⑤有机溶剂如PMSD（二甲基亚砜）、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺（dimethylacetamide）、二甲基甲酰胺（dimethylformamide）和sulphalane等；⑥用其它二价阳离子Mn2+、Cu2+、Co2+或Zn2+代替Mg2+。

星星活性的抑制措施：①减少酶的用量，避免过量酶切，减少甘油浓度；②保证反应体系中无有机溶剂或乙醇；③提高离子强度到100～150mM（在不抑制酶活性的前提下）；④降低反应pH至7.0；⑤使用Mg2+作为二价阳离子。

6.某DNA序列中存在DpnI酶切位点，以此DNA为模板，在体外合成DNA序列，当用该酶进行酶切时，发现切割不动，试分析可能原因？
生物体内的DNA序列可能是经过甲基化修饰的，而在体外合成时，缺乏这种修饰作用。

当用依赖于甲基化的限制酶DpnI来切割非甲基化的序列时，就会出现不能切割的情况。

7.天然的质粒载体（plasmid vectors）通常需经改造后才能应用，包括去除不必要的片段，引入多克隆位点等。

试问在此过程中如何增减酶切位点？
在酶切水平上，通过酶切和连接产生新的酶切位点。

①将产生的5'突出端补平后，再连接以产生新的酶切位点；②同尾末端的连接，不同的同尾酶切割DNA产生的末端，再相互连接时，可产生新的酶切位点，同时原来的酶切位点却消失；③平末端的连接
8.双脱氧终止法测定DNA序列的片段一般不能太长，如何运用本章所学知识测定较长片段的DNA序列？
①将所需要测序的DNA片断采用2种不同的限制性内切酶切割，产生不同的酶切片段，将此酶切片段连接到载体上，测序后，拼接，即可得到全长的DNA序列；②用一种限制性内切酶进行部分酶切，酶切产物与载体连接后，测序，拼接，即可得到全长DNA片断。

采用以上任一方法均可，需要注意的是，在进行部分酶切时，应该控制好条件，要确保所得到的酶切片断能覆盖所需测序的DNA片断。

9.大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ，具有3'--5’外切活性和5'--3'的聚合酶活性以及5'--3'的外切活性，试根据此推测该聚合酶可能具有哪些用途?
①利用E.coli DNA聚合酶的5'--3'外切核酸酶活性，可用切口平移法标记DNA，所有DNA 聚合酶中只有此酶有此反应；②用于cDNA克隆中的第二链，即单纯的DNA聚合活性；③对3'突出端的DNA作末端标记（交换或置换反应）。

10.用T4 phage DNA polymerase可进行末端标记，试简述其原理？
T4 phage DNA聚合酶具有3'--5'外切活性和5'--3'的聚合酶活性，3'--5'的外切活性可以被5'--3'的聚合活性所封闭，首先在反应体系中加入一种dNTP，产生3'凹端，然后加入经过标记的dNTP，利用T4 phage DNA聚合酶的聚合活性补平3'凹端，即可得到标记了末端的DNA片断。

11.BAP和CIAP有何作用？为何一般采用CIAP而不采用BAP？
作用：催化除去DNA或RNA 5'磷酸。

BAP抗性强，抗高温和去污剂。

CIAP可用蛋白酶K消化灭活，或在5mM EDTA下，65℃处理或75℃处理10分钟，然后用酚氯仿抽提，纯化去磷酸化的DNA，从而去除CIAP的活性。

相比之下，CIAP比BAP更易去除，因此，一般采用CIAP。

12.依赖于DNA的RNA聚合酶包括SP6噬菌体RNA聚合酶和T4或T7噬菌体RNA聚合酶，这类聚合酶可用于表达外源基因，阐述常用的构建策略？
①将T7 RNA聚合酶基因置于E.coli lacUV5启动子之下，插入到λ噬菌体中，感染E.coli，建立稳定的溶源菌。

E.coli BL21（DE3）菌株即为将lacUV5启动子和T7聚合酶基因置于
λ噬菌体DE3区，该λ噬菌体DNA整合于染色体的BL21处。

若将T7噬菌体启动子控制的目的基因经质粒载体导入该宿主菌中，在IPTG诱导下，可启动外源基因的表达；②先导入带T7噬菌体启动子控制的目的基因的质粒，再用λ噬菌体（带T7 RNA聚合酶基因）感染
E.coli，激活目的基因的表达。

13.简述T4多核苷酸激酶的活性和用途？
T4多核苷酸激酶的活性催化ATP的γ－磷酸基转移到DNA或RNA的5'末端。

可表现为两种反应，正反应指ATP的γ－磷酸基被转移到去磷酸化的DNA 5'端，用于对缺乏5'－磷酸的DNA进行磷酸化。

在交换反应中，过量的ATP可使该激酶将磷酸化的5'端磷酸转移给ADP，然后DNA从【γ－32P】ATP中获得放射性标记的γ－磷酸而重新磷酸化，因此可用于DNA 的末端标记。

用途：该酶主要用于对缺乏5'－磷酸的DNA或合成接头进行磷酸化，同时可对末端进行标记。

通过交换反应，用于标记5'末端，以供Maxam－Gilbert法测序、S1核酸酶分析以及其它须使用末端标记DNA的步骤。

14.限制性内切酶可划分为哪几个类型，各自有何特点？
15.哪些酶可用于DNA片段的末端标记？
16.DNA聚合酶有哪些类型，各有什么活性？
17.在分子克隆中所用的酶主要作用于哪些底物？
第三章分子克隆载体
名词解释：
1.载体：将外源DNA或基因携带入宿主细胞（host cell）的工具称为载体。

具备以下三个必须元件：复制原点、多克隆位点和筛选标记。

2.基因克隆：克隆作动词时，指从单一祖先产生同一的DNA分子群体或细胞群体的过程；作名词时指从一个共同祖先无性繁殖下来的一群遗传上同一的DNA分子、细胞或个体所组成的特殊的生命群体。

利用重组DNA技术分离目的基因，称之为基因克隆。

3.基因文库：由大量的含有基因组DNA（即某一生物的全部DNA顺序）的不同DNA片段的克隆所构成的群体，称之为基因文库。