根瘤菌和植物(豆科)之间的相互作用分子机制

1.3 共生关系(Symbiosis)：
指一个以上的有机体，双方建立互利共存或 一方有利对方无害地生活在一起的一种关系，生 物之间共生关系有利于共生体对外界自然环境的 生存适应。
根瘤菌与相应的豆科植物及少数非豆科植物根系共生形成根瘤，能 将空气中的分子态氮还原为植物可利用的氨，对自然界的氮素循环起着 十分重要的作用，豆科植物为根瘤菌提供生长繁殖所需的能量和营养物 质。根瘤菌感染豆科植物形成根瘤共生体，是由根瘤菌和寄主植物2方面 的遗传因素所决定，根瘤菌具备实现固氮功能的全部遗传因子，寄主植 物提供固氮作用所需的条件。
分离纯化的结瘤因子在高于1nmol/L的浓度可以诱导其 宿主植物根毛变形。研究表明，结瘤因子的脂肪酸链是其诱 导根毛变形所必需的，而脂肪酸链的结构相对来说不是很重 要。
（3）侵染和侵染线的形成
侵染线,即在根毛卷曲部位植物细胞壁局部水解，细 胞质膜向内生长，同时新的细胞壁物质沉积在内陷的质 膜处，形成一种管状结构。细菌就是通过侵染线传递到 根内皮层的植物细胞中去的。 随着侵染线向根毛基部生长，在被侵染部位高度液泡 化的根皮层细胞被激活，这些活化的细胞进行细胞质重排， 形成横跨中央大液泡的辐射状胞质桥，这种胞质桥被认为 是“为侵染线通过作准备”，因而被称为前侵染线。
免疫细胞化学研究证明该基因编码的蛋白主要存在于侵染线中和刚释放的根瘤菌外膜上而在固氮根瘤菌中则不存有几个结瘤素基因的表达开始于固氮前区的基部而持续到固氮区比如psenod3psenod14和豆红蛋白基因lbpsenod3和psenod14的表达始于固氮前区的上部在间隔区达到最高水平而在间隔区向固氮区过渡时表达开始下降
生命科学学院 遗传学 冯刚
1.相关概念
1.1 根瘤菌(Rhizobia)：是一类广泛分布于土壤中
的革兰氏阴性细菌，它可以侵染豆科植物根部形成 根瘤，固定空气中的分子态氮形成氨，为植物提供 氮素营养。
1.2 根瘤菌的分类：
根瘤菌的早期分类一直是以互接种族(cross-in-oculation group)为主要依据的。 1932年，Fred等人首次提出了根瘤茵分类系统，他们 根据互接种族的关系，将全部根瘤菌定义为1属5种。
2. 参与共生固氮的物质基础
从生物化学和分子生物学角度来看，豆科植物一根瘤茵的相 互识别属亲和性(阴性)识别系统，吸附的专化性取决于分子识别， 参与分子识别的物质包括豆科植物凝集素(lectin)、类黄酮和根 瘤菌表面多糖，并将它们分别称为植物识别子(cognor)与细菌识 别子(cognon)。分子识别即植物识别子与细菌识别子间结构互补 的特异结合。
3. 与共生固氮相关的基因
3.1 与共生固氮有关的根瘤菌基因
在豆科植物－根瘤菌共生固氮体系中，参与根瘤发育的根瘤菌基因 可分为3类：第1类是结瘤基因(nod, nol, noe)；第2类是与细菌细胞表 面结构有关的基因(exs, lps, ndv)；第3类是固氮基因(nif, fix)。
结瘤基因 主要功能是共生关系早期过程中信号分子的形成与交换。它们位于根瘤菌的 共生质粒(sym plasmid)上，包括3组：调节基因(nodD)，共同结瘤基因(nodABCIJ) 和宿主专一性基因（又叫基因hsn），如nodH。
EPS或CPS本身是一种可以与相应植物凝集素特异结合的半抗原， 而LPS作为cognon时必须是完全型的，即含O一抗原；O一抗原中的糖 组分有细菌种的特异性，使LPS在作为cognon起作用时表现出专化性。 sander等(1978)从豌豆根瘤菌和寄主共生的相互作用中，证实了豌豆根 瘤菌荚膜多糖和胞外多糖的重要性，他们指出豌豆根瘤菌的突变株由于 不能合成正常量的胞外多糖，以致不能使豌豆植物结瘤。
①调节基因nodD 存在于所有根瘤菌中，一般是组成型表达。其产物可激活其它nod基因的 表达，但它的激活又受到宿主植物专一的黄酮类物质的调节。原因是，nod蛋 白在类黄酮的存在下能够和nodD基因启动子中的30~60bp长的高度保守的核 苷酸序列，即nod box结合。所以一般认为，nodD是一转录结合物，调节其 它nod基因的表达。 ②共同结瘤基因 nodABCIJ 存在于所有根瘤菌中，具有较高同源性，并且在功能上是互补的，它对 豆科植物根毛卷曲和皮层细胞分裂是必须的。 ③宿主专一性基因 控制根瘤菌的宿主范围。 目前，已克隆的结瘤基因约有50多个。
ENOD5蛋白在其N-端也有潜在的信号肽，它除了富含脯氨酸外，还含 有较高的丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸。这表明，ENOD5蛋白可能是一种类似 阿拉伯半乳聚糖蛋白的蛋白质，因而ENOD5可能是侵染线壁或膜的组成部 分。分离纯化的结瘤因子能诱导与侵染有关的结瘤素基因ENOD12和 ENOD5，但不能诱导侵染线形成。
RNA原位杂交研究表明，PsENOD12基因特异地在根瘤菌接种后的根毛 细胞和含侵染线的根皮层细胞中表达，而PsENOD5基因只在侵染线前部的皮 层细胞中表达。ENOD12和ENOD5编码的多肽都含有较高的脯氨酸。
ENOD12多肽的大部分是由重复的Pro-Pro-Gln-Lys-Glu和Pro-ProHis-Lys-Lys2种五肽单位组成，在该蛋白的N-端有一个可能的信号肽。这 些特征表明，ENOD12多肽很可能是富含（羟）脯氨酸的细胞壁蛋白，因 此很可能是侵染线和为侵染线形成作准备的细胞壁组成部分。
与根瘤菌细胞表面结构有关的基因，即与胞外多糖(EPS)、脂多糖(LPS) 和中性葡聚糖合成有关的基因，分别称exs, lps和ndv基因。它们对建立共生 固氮关系是很重要的，这类基因突变，导致不能形成侵入线或形成空瘤。
固氮基因
固氮基因可分为固氮酶基因（nif基因）和共生固氮基因 （fix基因）。 nif基因是固氮微生物所共有的，有高度的保守性，它与肺 炎克氏杆菌(K.Pneumonic)有同源性的固氮酶结构或调节基因。 其中，nifA是转录调节基因，它对其它nif基因和某些基因进行 正调控；nifDH是固氮酶的结构基因；nifL是负调节基因。 fix基因是只在根瘤菌中发现的、控制共生固氮作用的基因， 其中fixABC在电子传递中可能具有作用；已报导fixC对膜嵌入 有一个信号序列；fixLJ对nifA基因转录调节。
具体过程：
当豆科植物在幼苗期，土壤中的根瘤菌便被其根毛分泌的有机物吸引而聚集 在根毛的周围，并大量繁殖。同时产生一定的分泌物，这些分泌物刺激根毛，使 其先端卷曲和膨胀，同时，在根菌瘤分泌的纤维素酶的作用下，根毛细胞壁发生 内陷溶解，随即根瘤菌由此侵入根毛。 在根毛内，根瘤菌分裂滋生，聚集成带， 外面被一层粘液所包，形成为感染丝，并逐渐向根的中轴延伸。同时，在根瘤菌 的刺缴下，根细胞相应地分泌出一种纤维素，包围于感染丝之外，形成了具有纤 维素鞘的内生管，又称侵入线。根瘤菌顺侵入线进入幼根的皮层中。 在皮层内，根瘤菌迅速分裂繁殖，皮层细胞受到根瘤菌侵入的刺缴，也迅速 分裂，产生大量的新细胞。致使皮层出现局部的膨大。这种膨大的部分，包围着 聚生根瘤菌的薄壁组织，从而形成了外向突出生长的根瘤。
之后，含有根瘤菌的薄壁细胞的细胞核和细胞质逐渐被根瘤菌所破坏而消失， 根瘤菌相应地转为拟菌体(bacterioid)。
主根瘤菌刚刚进入豆科植物根部的时候，并不能固氮， 只能发展到拟菌体阶段，才能进行固氮作用。
在根瘤内，根瘤菌从豆科植物根的皮层细胞中吸取碳 水化合物、矿质盐类及水分。以进行生长和繁殖。同时它 们又把空气中游离的氮通过固氮作用固定下来，转变为植 物所能利用的含氮化合物，供植物生活所需。这样，根瘤 菌与根便构成了互相依赖的共生关系。
5.共生固氮各阶段的信息传递 和基因表达
（1）根际的殖民化
• 根瘤菌对豆科植物根际的殖民化是由细菌的趋化性和根分 泌物刺激根瘤菌生长的潜力来决定的，关于趋化性的信号 机理还不清楚。
选择吸附学说认为，根瘤菌对豆科寄主植物与非寄主植物根 毛吸附的选择性，是致瘤专化性的重要原因，一种根瘤菌或 其特定菌系（菌株）只能特异性地侵染其来源寄主和少数其 他寄主并诱发根瘤。
4.共生固氮过程
豆科植物－根瘤菌相互识别属亲和性(阴性)识别系统，它 们之间相互作用形成根瘤的过程可分为5个阶段：
（1）根瘤菌趋化性地接近根毛细胞，并在植物根际繁殖，即根际的 殖民化； （2）根毛细胞变形弯曲； （3）细菌诱导根毛细胞形成一种管状结构—侵染线；
（4）根皮层细胞分裂形成根瘤原基；
（5）根瘤原基分化形成各种根瘤组织，最后形成成熟的固氮根瘤。
与根瘤菌细胞表面结构有关的基因 根瘤菌的结瘤基因表达后，将合成并分泌一类脂寡糖化合物，即结瘤 因子，作为根瘤菌返还给宿主植物的信号分子。
研究表明，所有根瘤菌分泌的结瘤因子都具有相似的骨架结构：一个由 3~5个N－乙酰氨基葡糖组成的糖骨架和在还原糖末端C2上连的一条脂肪酸链 构成。但不同根瘤菌来源的结瘤因子在侧链上羟基的取代基团、脂肪酰链的 长度和不饱和方面表现出较大的差异，而这些结构的差异是与根瘤菌的宿主 范围紧密相关的。
2.1 豆科植物凝集素
豆科植物的凝集素是其分泌的一种糖蛋白，它在 吸附中有3种功能：
作为媒介联结菌体和根毛细胞； 对糖残基结合的特异性使吸附具有专化性； 与细菌的cognon结构互补、相互联结。
2.2 类黄酮
• 类黄酮属于植物次生物质，不直接参与豆科植物—根 瘤菌分子识别反应。 已有研究证实类黄酮能专一地诱导nod基因的表达，从 而刺激NodRm因子的产生。 TonVan Brussel等认为nod基因的诱导物是nod基因本身， 并发现豌豆根瘤菌胞外多糖能诱导8种新的诱导nod基因表达 的类黄酮产生，这种受根瘤菌诱导而新合成的类黄酮又通过 诱导nod基因的表达而控制根瘤菌表面多糖的产生，这样识 别信号不断放大。
3.2 与共生固氮有关的植物基因
在根瘤发育的各个阶段，一些植物基因得到特异性表达， 这些在根瘤发育中特异表达的植物基因被称为结瘤素(nodulin) 基因。 在根瘤固氮开始之前，表达的植物基因被叫做早期结瘤素 基因(ENOD)，相反在固氮开始时和之后，表达的植物基因则 称为晚期结瘤素基因(NOD)。
（2）根毛细胞变形和卷曲
对根毛变形和卷曲有关的基因表达的研究主要是，通 过比较接种野生型根瘤菌和nodABC突变体的，或者未接种 的根毛细胞mRNA的体外翻译蛋白图谱的差异来完成的。 有两种mRNA体外翻译蛋白：RH-42和RH-44只在接种 后的根毛细胞中得到增强，这两种蛋白质可能和根毛变形与 卷曲有关，而根瘤菌能促进根毛细胞发育。RH-42基因的诱 导表达和RH-44基因表达的增强需要nod基因产物的存在。
表1根瘤菌分类系统
Table 1 Fred Rhizobium classification system 种名 苜蓿根瘤菌(R.meliloti) 三叶草根瘤(R.trifolii) 豌豆根瘤菌 (R.leguminasarum) 菜豆根瘤菌(R.phasoli) 羽扇豆根瘤菌(R.lupini) 寄主植物的属名 菖蓿属(Medicago) 胡芦巴属(Trigonella) 车轴草属(Tri如lium) 豌豆属(Pisum)野豌豆属(Vicia) 香豌豆属(Lathyrus)兵豆属(Lens) 菜豆属(Phaseolus) 羽扇豆属(Lupinus)
Enod一般是在根瘤接种数小时后到根瘤形成、固氮作用 之前出现。据报道，不同植物根瘤的Enod有所不同，但共同 的是都有Enod2, Enod5, Enod12, Enod40等。Nod大多数在 根瘤有固氮活性前表达，与固氮作用密切相关。研究最多的是 豆血红蛋白(Lb)，为固氮过程中固氮酶兼氧所需。
2.3 根瘤菌表面பைடு நூலகம்糖
• 根瘤菌表面具有与凝集素有特异结合能力的多糖，包括 胞外多糖、荚膜多糖和脂多糖：EPS是根瘤菌分泌到细 胞之外的多糖，CPS存在于根瘤菌的荚膜中，LPS是细 胞壁成分。
根瘤菌的cognon依互作体系的不同而不同，是3种多糖中的1、2或 3种，它们调节不同类型的吸附，并非同时参与作用。
Jordan在1984年出版的《伯杰系统细菌学手册》(第 一卷)中，总结了前人数值分类、DNA碱基组成、DNA同源 性、血清血分析、胞外多糖成份分析、全细胞可溶性蛋白 电泳和rRNA-DNA杂交等大量研究结果，对根瘤菌科分类系 统进行了修订。
随着原核生物分类技术的改进和根瘤菌研究工作的深入，对 根瘤菌系统发育的研究也随着根瘤菌分类系统的不断补充与 完善而得以系统化、科学化。其后又发现了许多新种，并确 定了其分类地位，目前，根瘤菌科已发展到7属36种。