乳腺癌中转录因子DLX4与EMT相关蛋白的表达及意义

乳腺癌中转录因子DLX4与EMT相关蛋白的表达及意义张连美;仲纪祥;孙苏安
【摘要】目的探讨转录因子DLX4与上皮细胞-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关蛋白在乳腺癌组织和乳腺细胞系中的表达及其相关性.方法收集100例乳腺癌及对应癌旁组织标本,采用免疫组化SP法和Western blot法检测乳腺癌组织和乳腺细胞系中DLX4与EMT相关蛋白E-cadherin和vimentin的表达,并分析三者与乳腺癌临床病理特征的关系.结果乳腺癌组织中DLX4和vimentin阳性率(68.0％和53.0％)显著高于癌旁组织(22.0％和28.0％)(P＜0.05),乳腺癌组织中E-cadherin阳性率(32.0％)显著低于癌旁组织(76.0％)(P＜0.05).Western blot法检测结果显示,在高侵袭性乳腺癌细胞系中DLX4、vimentin均呈高表达,E-cadherin呈低表达;DLX4、E-cadherin及vimentin的表达与乳腺癌TNM分期和淋巴结转移相关.Spearman相关分析结果显示,乳腺癌中DLX4与E-cadherin表达呈负相关(rs=-0.505,P=0.000),DLX4与vimentin表达呈正相关(rs =0.165,P=0.016).结论乳腺癌中转录因子DLX4与E-cadherin表达呈负相关,与vimentin表达呈正相关,可能存在调控关系,从而促进乳腺癌的局部侵袭和远处转移.
【期刊名称】《临床与实验病理学杂志》
【年(卷),期】2016(032)007
【总页数】4页(P731-734)
【关键词】乳腺肿瘤;转录因子;DLX4;EMT相关蛋白
【作者】张连美;仲纪祥;孙苏安
【作者单位】江苏省淮安市第一人民医院病理科 223300;江苏省淮安市妇幼保健院不孕不育科 223002;江苏省淮安市第一人民医院病理科 223300
【正文语种】中文
【中图分类】R737.9
乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一[1]，发病率60/10万以上，居女性恶性肿瘤的首位，严重影响女性身心健康，甚至危及生命。

乳腺癌发病年龄高峰为45～55岁[2]，其病因目前尚不完全清楚，遗传、内分泌、机体免疫等多种内源性因素促进了乳腺癌的发生、发展[3]。

转录因子DLX4有癌基因的特征，E-cadherin和vimentin是上皮细胞-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)相关蛋白，与乳腺癌的侵袭和转移密切相关。

本文现收集100例乳腺癌患者的组织标本及乳腺癌细胞系进行分析，着重探讨转录因子DLX4与EMT相关蛋白在乳腺癌组织中的表达及其相关性。

1.1 临床资料选取2014年1月～2015年1月江苏省淮安市第一人民医院收治的乳腺浸润性导管癌标本100例，病理分级为Ⅰ级者34例、Ⅱ级者46例、Ⅲ级者20例。

本组100例乳腺浸润性导管癌标本均符合以下标准：(1)均经病理学专家确诊为乳腺浸润性导管癌和癌旁组织；(2)均未经放、化疗；(3)患者随访资料完整。

1.2 试剂鼠抗单克隆抗体E-cadherin、兔抗单克隆抗体vimentin，均购自北京中杉金桥公司；羊抗单克隆抗体DLX4、鼠抗单克隆抗体β-actin，均购自Santa Cruz公司；乳腺癌细胞系MDA-MD-231细胞，购自ATCC细胞库。

免疫组化采用SP法，购自北京中杉金桥公司，具体操作步骤严格按试剂盒说明书进行。

脱蜡水化，抗原修复，滴加一抗，4 ℃过夜，PBS洗涤，滴加二抗，PBS洗涤，DAB 显色，苏木精复染后用双蒸水洗涤，脱水、透明、封固。

1.3 方法
1.3.1 免疫组化采用免疫组化SP法染色，并由两名专业病理医师应用双盲法阅片。

DLX4阳性信号呈棕黄色或棕褐色，表达于细胞膜，E-cadherin阳性信号为棕黄色，表达于细胞膜；vimentin表达于胞质，样本中DLX4、E-cadherin以及vimentin阳性细胞所占总细胞的比例分为4个等级：<5%为阴性、5%～25%为
阳性、26%～50%中等阳性、>50%强阳性。

1.3.2 培养乳腺癌细胞系MDA-MD-231细胞收集细胞后添加裂解液提取蛋白，
上样缓冲液混匀后煮沸变性，室温静置冷却后置于-20 ℃保存备用。

经10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转移至硝酸纤维素(NC)膜上，用5%脱脂牛奶封闭1 h后，分别加入鼠抗β-actin单克隆抗体(1 ∶2 000)、羊抗DLX4(1 ∶500)、鼠抗E-cadherin(1 ∶1 000)以及兔抗vimentin(1 ∶1 000)，4 ℃过夜，次日洗膜3次，加入相应的二抗HRP(1 ∶2 000)，37 ℃反应2 h。

洗膜3次，NBT/BCIP显色，水洗终止反应。

用图像处理仪(Gene Company)扫描，Image J软件进行半定量分析。

1.4 统计学处理应用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计数资料以绝对数和百分
率表示，计量资料采用±s表示，组间比较采用t检验或χ2检验，DLX4、E-cadherin及vimentin相关性分析采用Spearman相关性分析法，P<0.05差异有统计学意义。

2.1 乳腺癌组织中DLX4、E-cadherin及vimentin的表达乳腺癌组织中DLX4和vimentin阳性率分别为68.0%和5
3.0%，显著高于癌旁组织；乳腺癌组织中E-cadherin阳性率为32.0%，显著低于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05，表1，图1)。

2.2 乳腺癌细胞系中DLX4、E-cadherin及vimentin的表达应用Western blot
法检测乳腺癌细胞系，结果显示在乳腺癌细胞系MDA-MD-231细胞中DLX4呈
高表达，E-cadherin呈低表达，vimentin呈高表达(图2)。

2.3 DLX4、E-cadherin及vimentin与乳腺癌临床病理特征的关系 DLX4、E-cadherin及vimentin表达与乳腺癌TNM分期和淋巴结转移相关，具体见表2。

2.4 乳腺癌组织中DLX4、E-cadherin及vimentin的相关性分析 Spearman相关性分析结果显示：乳腺癌中DLX4与E-cadherin表达呈负相关(rs=-0.505，
P=0.000)，DLX4与vimentin表达呈正相关(rs=0.165，P=0.016，表3、4)。

DLX4又称为BP1，是第一个从胎盘中分离出来的同源异型盒转录因子DLX基因
家族成员，该基因定位于人类染色体17q21-22上[4]。

在正常妊娠时，DLX4主
要调节胎盘的发育，包括骨的形态发生和骨的形成[5,6]。

正常成人各组织中DLX4一般不表达，而在乳腺浸润性导管癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌、急性T淋巴细胞
白血病等多种肿瘤中均有异常高表达[7]。

其中DLX4与乳腺癌的关系成为近年研
究热点，DLX4表达在乳腺癌中随肿瘤分级的升高呈上升趋势，并且在雌、孕激素受体阴性的肿瘤中阳性率更高。

在妇科肿瘤中对DLX4的分析发现，在绒癌细胞
中DLX4表达明显高于细胞滋养细胞和正常胎盘组织，而且抑制DLX4表达可以
诱导绒癌细胞凋亡[8]。

相关分析表明，JEG-3细胞侵入子宫内膜间质的能力比JAR细胞强，而DLX4基因在JEG-3细胞中的表达较JAR细胞多，提示DLX4还
可能调控滋养细胞的侵袭力。

在正常卵巢上皮中不表达的DLX4在卵巢癌高表达，并能促进肿瘤细胞增殖和侵袭力，显示DLX4有癌基因的特征[9]。

恶性肿瘤转移调控机制是近年来肿瘤生物医学研究关注的热点。

肿瘤的转移是一个复杂的、多步骤的过程，主要包括以下几个方面：(1)上皮细胞失去极性，细胞与
细胞之间和细胞与细胞间质之间的黏附作用减弱，细胞骨架得以重塑获得了侵袭与转移能力；(2)肿瘤细胞侵袭周围组织，突破基膜侵入血管或淋巴管；(3)通过血液循环转移至远处组织并继续生长[10]。

EMT的重要特征是上皮性标志物E-cadherin、α连环蛋白、β连环蛋白和γ连环蛋白表达下调，而间充质蛋白vimentin、Fibronectin和SMA表达升高[11]。

其
中EMT的主要特征是E-cadherin表达降低，vimentin表达升高[12]。

有文献报道，EMT是通过一些重要的转录因子识别并结合在E-cadherin启动子上E-box
基序的DNA结合序列而诱导发生[13]。

本实验发现，DLX4在乳腺癌组织中呈高表达，且在高侵袭性的癌细胞系中呈高表达，也有文献报道在低侵袭性的癌细胞系中呈低表达。

提示DLX4在乳腺癌组织
中可能诱导EMT的发生[14]。

本组采用免疫组化SP法检测100例乳腺癌患者，
发现乳腺癌组织中DLX4和vimentin阳性率显著增高，而乳腺癌组织中E-cadherin阳性率显著降低；同时三者均与乳腺癌TNM分期和淋巴结转移相关，
而在高侵袭性乳腺癌细胞系中也表现出相似的结果，表明EMT参与乳腺癌的发生、发展，其可能机制是通过降低肿瘤细胞间的黏附力，使乳腺癌更容易发生浸润和转移。

进一步分析发现DLX4与E-cadherin表达呈负相关，与vimentin表达呈正相关，表明DLX4可能通过调节E-cadherin及vimentin的表达使乳腺癌上皮细胞获得
间质细胞的特性，进而促进EMT的发生。

同时提示DLX4阳性率较高的乳腺癌患者更易发生淋巴结转移和远处转移。

本实验仅对高侵袭性乳腺癌细胞系MDA-
MD-231细胞中DLX4、E-cadherin及vimentin的表达进行分析，尚缺少相关调节实验，后续还需进一步深入分析其调节机制。

综上所述，乳腺浸润性导管癌中转录因子DLX4与E-cadherin表达呈负相关，与vimentin表达呈正相关，三者可能存在调控关系，从而促进乳腺癌的局部侵袭和
远处转移。

2江苏省淮安市妇幼保健院不孕不育科 223002
孙苏安，女，主任医师，通讯作者。

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【相关文献】
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