12染色体标本的制备

实验十二染色体标本的制备
一、实验目的
1.了解利用动物骨髓进行细胞染色体制片的一般方法，
2.掌握细胞收集、低渗、滴片等技术手段。

3.观察和了解小鼠染色体的数目及形态特征。

二、实验原理
染色体上的基因决定了一个物种生长发育的全部信息。

因此通过染色体分析，可以了解某一物种最基本的遗传指标。

进行染色体标本的制备一般取自细胞分裂旺盛的组织，如骨髓、淋巴细胞以及通过人工培养的悬浮液。

将秋水仙素注射到动物的腹腔内，经肠系膜吸收可转运到骨髓，使正在分裂的细胞不能形成纺锤体，染色体停在中期状态，经过处理和制片后就可以清楚地观察到染色体。

这种制片方法是属于侵害性的，因此这种方法适用于动物来源丰富、动物个体较小的材料。

对于大型动物可以采取骨髓穿刺术获得红骨髓，在临床上用于一些血液疾病的研究分析。

对于一些珍稀的鸟类可采用羽髓来制片，方法基本一样。

人类的染色体分析可采用外周血培养的方法来获得大量的细胞材料。

骨髓细胞具有丰富的细胞质和高度分裂能力，因此不必经体外培养，也不需要植物血球凝集素（PHA）的刺激，可直接观察到分裂细胞。

经秋水仙素处理后，分裂的骨髓细胞被阻断在有丝分裂中期，再经离心、低渗、固定、滴片等步骤，便可制作出理想的染色体标本，是研究动物细胞遗传学的好材料。

骨髓细胞染色体标本的制备，具有取材容易，方法简单易行等优点，设备也简单，在一般的实验室均可进行。

三、实验仪器、材料和试剂：
1.仪器、用具
天平，离心机，光学显微镜，恒温水浴锅，试管架，烧杯，离心管，刀片，镊子，解剖盘，解剖剪，镊子，注射器，纱布，冰冻载玻片，吸水纸，吸管，镜头纸。

2.材料
体重20克左右的小鼠。

3.试剂
(1)0.075mol/L KCl低渗液
(2)Carnoy固定液（甲醇：醋酸＝3:1）
(3)0.1%秋水仙素
(4)Giemsa染色液
【方法与步骤】
1. 秋水仙素处理：在做实验前3~4小时，按每克体重2-4μg的量，向小鼠腹腔注射0.1％的秋水仙素。

2. 取股骨：用颈椎脱臼法迅速将小鼠处死，立即用剪刀剪去后肢的皮肤和肌肉，连同关节一起取下两侧股骨，用刀片剔净其上肌肉。

3. 取骨髓细胞：用刀片切开股骨两端，暴露出骨髓腔。

用注射器吸取6ml生理盐水，将注射器针头插入骨髓腔的一端，用生理盐水冲出骨髓细胞至离心管，反复冲洗直至骨腔变白。

将收集到的骨髓细胞溶液平衡后放入离心机，以1000r/min离心10min，吸去上清液。

4. 低渗：根据细胞量多少，加入0.075mol/L KCl低渗液5-6ml，用吸管轻轻吹打混匀，在37℃恒温水浴箱内低渗20分钟。

5. 预固定：低渗完毕，立即加1ml新配制的Carnoy固定液，轻轻吹打之后，以1000r/min离心10min，弃上清液。

6 固定：沿离心管壁缓慢加入固定液6ml，立即用吸管吹打成细胞悬液，室温下固定20min。

1000rpm的速度离心10分钟，弃去上清。

7. 再固定：重复步骤6的操作。

8 制备细胞悬液：沉淀物中加入0.3-0.5ml固定液，用吸管轻轻吹打成细胞悬液。

9. 滴冰片：从冰箱里取出预冷的载玻片，注意：玻片上的一层水膜不要擦干。

手持吸管在载玻片上方约20-30cm处向下滴片，2-3滴，然后立即用口或洗耳球对准滴片处向同一方向轻微吹气，使染色体分散和展开。

10.干燥：使滴片在室温下自然干燥。

11.染色：Giemsa染液室温下染色30分钟左右。

清水冲洗，在室温下自然干燥。

12.镜检：先用低倍镜找到一好的分裂相区域，然后转用高倍镜观察。

【注意事项】
1.秋水仙素用量
太多或处理时间过长，都会导致染色体的过分缩短或着丝点迅速裂解，最终使染色体被破坏或溶解。

2.取骨
取骨可参照人的大腿骨位置，而不是主观地判断其大小，取骨后一定要把肌肉除净，否则最后的制片效果会受到影响。

3.低渗处理
低渗液的浓度、处理时间直接影响实验的成败。

低渗过度时，细胞会破裂，造成染色体丢失；不足时则染色体聚集在一起，分散不好。

低渗液可以使细胞充分吸水膨胀而不破裂，从而一直保持在胀得很大而又没有破裂的状态。

进而使得细胞内的中期染色体就能够足够分散开来，从而使得经固定等步骤后仍然处于膨胀状态。

之后经过滴片时的摔打和骤降温过程，使细胞很快破碎，染色体进一步分散开。

如果细胞低渗处理不够，在细胞从高处掉下也无法摔碎，染色体将难以观察。

4.离心强度：
离心速度太高或离心时间过长，细胞积压成块，不易打散；速度过低或离心时间过短，细胞不易沉降，会丢失大量细胞。

5.固定液：
要现用现配，固定要充分，固定彻底后再打散细胞团块，否则细胞容易破碎，染色体分散亦收到影响。

6.载玻片：
要洁净，无油脂，要预先冰冻，滴片要有一定高度，以利于细胞和染色体充分分散。

【思考题】
1. 统计小鼠2N染色体数目，仔细观察其形态特征并绘图。

2. 低渗液起什么作用，在使用过程中应注意什么问题？。