Notch1和Hes1相关蛋白在膝关节骨性关节炎软骨组织中的表达

膝关节骨性关节炎（knee osteoarthritis ，KOA ）是一种以关节软骨破坏及骨质增生为主的伴有关节疼痛、肿胀、畸形及活动障碍的慢性关节疾病[1]。

据估计，2020年骨性关节炎在全世界范围内将成为第四大致残疾病[2]。

KOA 的病因和发病
机制目前尚未完全明确，随着研究的深入，以信
号通路为靶点进行研究KOA 的发病机制成为热点。

Notch 信号通路通过与靶基因Notch 1、Hes 1
的结合，
可以参与多种物质从细胞膜向细胞核的传递，介导如细胞生长、增殖及程序性死亡等过程[3]。

本研究通过对比KOA 软骨及正常软骨组织
中Notch1、Hes1相关蛋白的表达，探讨其在骨性关节炎发生发展中的作用及其意义，拟为KOA 的诊断、治疗及其预后提供新的临床思路。

1材料与方法1.1一般资料
标本收集自2018年3月1日—2019年2月
28日宁夏医科大学总医院骨科，由同组手术医
疗组骨科医师主刀，32例骨性关节炎标本均经
术前体征、病史、X 线影像确诊，
作为病例组。

其中女性20例，男性12例，年龄（53.32±9.22）岁；
HE 染色结果通过采用改良的Mankin 评分标准[4]
对关节软骨行病理分期：KOA 中期软骨组9例；KOA 晚期软骨组23例。

全部病例术前均未接受骨性关节炎针对性治疗。

对照组为16例膝关节
内骨折切开内固定术中去除的部分软骨组织，
其中女性6例，男性10例，年龄（45.32±11.22）岁，
无骨性关节炎病史。

术前均经患者或家属知情，并签署知情同意书。

1.2
主要试剂及仪器
苏木素、番红O 、多聚甲醛；
兔抗人Notch1单克隆抗体、兔抗人Hes1单克隆抗体（购自美国
Abcam 公司），山羊抗兔IgG （购自北京中山金桥有限公司）；DAB 显色试剂盒、PBS 缓冲液、柠檬
酸盐缓冲液（购自博士德生物工程有限公司）；Image Pro Plus 6.0图像分析软件（购自美国Me-
dia Cybernetics 公司）；H6023i 显微镜及图像采集系统（购自德国Leica 公司），CFX Connect 定量
PCR 仪（购自美国BIO-RAI 公司）。

1.3实验方法
1.3.1组织处理所有标本均截成0.5cm ×0.3cm×
Notch1和Hes1相关蛋白在膝关节骨性关节炎软骨组织中的表达
张
晨1，宋国瑞1，刘子歌1，陈德胜2
（1.宁夏医科大学临床医学院，
银川750004；2.宁夏医科大学总医院骨科，银川750004）文章编号：1674-6309（2020）01-0030-04
·论著·
收稿日期：2019-04-10
基金项目：国家自然科学基金（81760405；81760395；81560364）；宁夏医科大学校级课题重点项目
（XZ2018014）作者简介：张晨，男，在读硕士研究生，研究方向：骨科疾病的诊治。

通信作者：陈德胜（1972-），男，主任医师，教授，博士，硕士研究生导师，研究方向：人工关节临床与基础研究。

E -mail :*******************
摘要：目的探讨Notch1和Hes1相关蛋白在膝关节骨性关节炎发生发展中的作用。

方法选取2018年3月
1日—2019年2月28日于宁夏医科大学总医院骨科行人工全膝关节置换术术中去除的膝骨性关节炎软骨
标本32例作为病例组，选取膝关节内骨折切开复位去除的部分软骨组织16例作为对照组。

通过番红及HE 染色等形态学方法，将病例组分为中期软骨组（9例）及晚期软骨组（23例）。

采用免疫组化技术检测Notch1和Hes1蛋白在关节软骨组织中的表达，分析其在软骨中的表达与膝关节骨性关节炎发生发展的关系。

结果
通过免疫组化可观察到Notch1阳性表达率在对照组软骨组织中为（21.16±7.86）%，在中期软骨组为（33.62±5.87）%，在晚期软骨组为（47.12±4.33）%；Hes 1阳性表达率在对照组软骨组织中为（11.56±5.92）%，在中期软骨组为（27.42±6.27）%，在晚期软骨组为（33.47±4.63）%。

随软骨组织病变加重，Notch1和Hes1的阳性表达率相应增高（P 均<0.05）。

结论Notch1和Hes1相关蛋白参与膝关节骨性关节炎的发生发展，其着色强度随着膝关节软骨的磨损程度的加重而升高，可作为诊断膝关节骨性关节炎的参考指标之一。

关键词：膝关节骨性关节炎；Notch1；Hes1；免疫组化技术中图分类号：R684.3
文献标识码：A
DOI
:10.16050/ki.issn1674-6309.2020.01.006
0.2mol·L-1磷酸缓冲液中充分漂洗后置于ED-TA脱钙液中脱钙，每周更替一次脱钙液，待针刺组织而无明显阻力感时取出，冲洗24h，将组织沿矢状面切为4mm组织块，脱水、包埋、切片。

1.3.2番红染色组织切片于70℃烤箱中过夜，后分别经过二甲苯脱蜡20min2次，梯度乙醇脱水后，铁苏木精染色5min，蒸馏水冲洗，1%盐酸乙醇分化30s，蒸馏水冲洗2min，固绿染色5min，蒸馏水漂洗30s，番红染色5min，蒸馏水漂洗1min，乙酸漂洗1min，蒸馏漂洗1min，风干，二甲苯透明60s，中性树脂封固，显微镜下观察。

1.3.3HE染色将切片置于37℃恒温箱中过夜，后分别经过二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各20min，70%、80%、90%、95%乙醇各5min，超纯水5min 脱蜡入水。

随后在苏木素中染色
2.5min，超纯水冲洗干净，然后在1%盐酸乙醇中分化3s后自来水冲洗干净，ddH2O中反蓝20min，伊红染色3~5s，风干后用中性树脂封固，显微镜下观察。

1.3.4免疫组化组织切片于70℃烤箱中过夜，二甲苯脱蜡20min，脱蜡两次，梯度乙醇脱水后蒸馏水、PBS漂洗各3min。

组织片于柠檬酸钠缓冲液中微波炉煮沸13min，自然冷却后体积分数3%H2O2去离子水浸泡10min，PBS冲洗3次，分别滴加Notch1一抗、Hes1一抗，4℃冰箱孵育，8h后取出，PBS冲洗3次，滴加山羊抗兔IgG聚合物孵育15min，PBS冲洗3次，DAB显色液显色15s，PBS冲洗3次，苏木精复染5min，蒸馏水冲洗2次，1%盐酸乙醇分化若干秒，蒸馏水冲洗2min梯度乙醇复水，二甲苯透明后用中性树脂封固，显微镜下观察。

1.3.5切片结果判定所有切片采用双盲法由两位实验员独立阅片，进行结果评定。

HE染色结果通过Mankin评分标准，0~3分为正常软骨，4~11分为中期软骨，12~14分为晚期软骨。

免疫组化结果在40倍光镜下随机选取每张切片的5个视野，应用Image Pro Plus6.0图像分析软件，测评正常组、中期软骨组及晚期软骨组软骨细胞中Notch1、Hes1的阳性表达率，并进行对比。

1.4统计学方法
采用SPSS20.0软件进行统计学分析，以均数±标准差（x±s）表示，多组样本均数间比较选用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t法。

P≤0.05为差异有统计学意义。

2.1KOA软骨组织番红染色结果
对照组（16例）：软骨基质番红染色均匀、标本表面较完整，光滑度较好，软骨细胞形态规则，胞膜完整，胞质丰富，软骨细胞数量多，潮线完整清晰（图1A）；病例组（32例）：软骨表面不光滑，基质番红染色减退较重，软骨细胞数量重度减少、成簇分布，潮线不完整（图1B）。

2.2KOA软骨组织HE染色结果
对照组（16例）：软骨表面完整，软骨细胞较多，排列较规整，潮线规整，偶见失染现象（图2A）；病例组（32例）：软骨面不整，细胞凋亡较多，细胞排列紊乱，软骨细胞减少，潮线中断且部分消失，染色不均且有失染现象（图2B）。

按Mankin评分标准，从软骨结构、软骨细胞数量、软骨基质染色以及潮线完整性进行评分，根据评分结果将病例组分为中期软骨组9例、晚期软骨组23例（表1）。

2.3免疫组化检测KOA软骨组织Notch1、Hes1表达结果
Notch1蛋白着色区域在正常细胞内广泛分布于细胞核，细胞质内少量表达（图3A）；在病例组软骨中，可见胞质内有游离Notch1蛋白（图3B）。

Hes1蛋白着色区域主要集中在细胞质中，呈黄色或棕色颗粒（图4A）。

Hes1主要作用于细胞外基质中的胶原纤维，在软骨细胞外基质中也图1KOA软骨组织番红染色（×40）
图2KOA软骨组织HE染色（×40）
表1KOA软骨组织Mankin评分（x，分）
组别n Mankin评分
对照组16 1.68±1.06
中期软骨组98.47±3.39
晚期软骨组2313.11±0.88
存在游离的Hes1蛋白，在病例组软骨细胞外基
质中可看到颜色变化（图4B ）。

Notch1和Hes1在对照组与病例组软骨细胞
中阳性表达率见表2、表3。

中期软骨组与晚期软
骨组、对照组间差异均有统计学意义（P 均<0.001）；
两两比较发现中期、晚期软骨组Notch1、Hes 1阳性表达率均高于对照组（P 均<0.05），晚期组阳性表达率高于中期组（P 均<0.05）。

3
讨论
Sassi 等[5]提出了Notch 信号通路在KOA 中的作用，针对骨性关节炎软骨组织的研究也越来越多。

Notch 信号通路是在Notch 配体与受体结合后开始激活的，即生成胞内区（Notch intracel-lular domain ，NICD ）与细胞核中DNA 结合蛋白结合后激活下游靶基因如Notch1、Hes1相关蛋白[6]。

据研究统计[7]，Notch1蛋白的活化出现在56%~63%的骨性关节炎中，是常见的导致骨性
关节炎的信号通路效应蛋白。

本研究证实，
Notch1在病例组软骨组织中有阳性表达，且高于对照组。

由于被异常激活后的Notch1蛋白可以刺激巨噬细胞、炎性因子持续存在，
导致骨代谢平衡能力下降，增加骨赘的形成，所以在关节畸
形中发挥关键作用[8]。

Hes1蛋白是Notch 途径的重要组成部分，
是一种强碱性螺旋环螺旋转录抑制因子（bHLH ），
Hes1蛋白的激活可以降解软骨基质的蛋白聚糖酶5（ADAMTS5）的血小板凝血酶敏感蛋白样序
列1区（TSP-1）及基质金属蛋白酶（MMP13）[9]。

蛋白聚糖酶5含有一个结合Hes1的典型序列，其中包含IL-6、IL-1、IL-33受体编码的靶基因。

而IL-1及IL-6是诱发关节炎症和软骨退化的炎症细胞关键因子[10]。

在本实验中，Hes1蛋白在对照组及病例组软骨组织中均存在阳性表达，且晚期软骨组织中的阳性表达率要高于中期软骨组织，说明Hes1蛋白参与了膝关节软骨磨损、退变的过程。

研究表明[11]，在KOA 中，Hes1通过抑制间充质前体细胞（mesenchymal progen itor cells ，MPCs ）向软骨细胞分化，促进破骨细胞的
分化成熟，增强其骨吸收活性并阻止其凋亡，骨再生能力受损，软骨组织出现不可逆性退化，甚至凋亡，出现骨性关节炎。

所以，本实验通过对Notch1和Hes1相关蛋白的形态学及免疫学检测，证实了其在KOA 组
织中存在，
且Notch1和Hes1蛋白的阳性表达率随着关节软骨磨损程度的加重而升高，证实其参与甚至主导了骨性关节炎中异常细胞激活和分
化过程，导致骨代谢失衡、骨质破坏，正常软骨细
胞炎性改变，
形成KOA 。

在异常活化的Notch-1及Hes1相关蛋白持续作用下，病变的骨细胞及
软骨细胞无法自行修复，在后期软骨病变及骨赘的形成过程中起到关键作用[12]。

综上所述，Notch1
和Hes1相关蛋白参与了KOA 的发生发展，可作为诊断膝关节骨性关节炎的参考指标之一。

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［3］Guan YJ ，Li J ，Yang X ，et al.Evidence that miR -
与对照组比较*P <0.05，与中期软骨组比较#P
<0.05
图3免疫组化检测KOA 软骨组织
Notch1蛋白表达（×40）
图4
免疫组化检测KOA 软骨组织
Hes1蛋白表达
（×40）组别n Notch1阳性细胞率/%
F 值P 值
对照组1621.16±7.86中期软骨组933.62±5.87*39.660<0.001
晚期软骨组
23
47.12±4.33*#
表2免疫组化检测KOA 中期、晚期病例
软骨Notch1阳性细胞率比较（x ±s ）与对照组比较*
P <0.05，与中期软骨组比较#
P <0.05
组别n Hes1阳性细胞率/%
F 值
P 值
对照组1611.56±5.92中期软骨组927.42±6.27*18.632<0.001
晚期软骨组
23
33.47±4.63*#
表3
免疫组化检测KOA 中期、晚期病例
软骨Hes1阳性细胞率比较（x ±s ）42卷
宁夏医科大学学报32··
Expression of Notch1and Hes1Related Proteins in Cartilage Tissue of KOA
ZHANG Chen 1，SONG Guorui 1，LIU Zige 1，CHEN Desheng 2
（1.School of Clinical Medicine，Ningxia Medical University ，Yinchuan 750004，China；2.Department of
Orthopaedics，the General Hospital of Ningxia Medical University，Yinchuan 750004，China）
Abstract ：Objective To explore the role of Notch1and Hes1related proteins in the development of knee
osteoarthritis.Methods Thirty-two knee osteoarthritis cartilage specimens removed from artificial total knee arthroplasty in the Department of Orthopedics，General Hospital of Ningxia Medical University from March 1，2018to February 28，2019were selected as case group.Sixteen cartilage specimens which were obtained from patients with partial cartilage tissue removed by fracture incision and reduction were used as the control group.According to morphological methods such as saffron and HE staining，the cases were divided into middle cartilage group （9cases）and advanced cartilage group （23cases）.Immunohistochemistry was used to detect the distribution and expression of Notch1and Hes1proteins in osteoarthritis cartilage tissue，and to analyze the relationship between the expression of Notch1and Hes1in cartilage and the occurrence and development of osteoarthritis.Results It was observed by immunohistochemistry that the positive expression rate of Notch1was （21.16±7.86）%in control cartilage tissue，（33.62±5.87）%in middle cartilage group，and（47.12±4.33）%in advanced cartilage tissue.The positive expression rate of Hes1was （11.56±5.92）%in control cartilage tissue，（27.42±6.27）%in middle cartilage group，and （33.47±4.63）%in advanced cartilage tissue.With the increase of cartilage tissue lesions，the positive expression rate of the two factors increased correspondingly （P all <0.05）.Conclusion Notch1and Hes1can participate in the occurrence and development of knee osteoarthritis.Its staining intensity increases with the abrasion of knee cartilage，which can be used as one of the reference indicators for the diagnosis of knee osteoarthritis.Key words ：knee osteoarthritis；Notch1；Hes1；immunohistochemical technique
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（责任编辑：李晓玉）。