核酸分离纯化-经典版
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➢长期保存样品中可加入1滴氯仿。
（五）核酸的鉴定与保存
2. 核酸的保存——RNA的保存
➢RNA样品溶于0.3 mol/L NaAc (pH5.2)或双蒸灭菌 水中，-70℃保存 ➢长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中; ➢在RNA溶液中，加1滴0.2 mol/L VRC(氧钒核糖核苷 复合物)冻贮于-70℃,可保存数年。
➢ 保存介质： 灭菌水 TE缓冲溶液(最常用)： 10mmol/L Tris-Cl pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0
（五）核酸的鉴定与保存
2. 核酸的保存——DNA的保存
➢DNA样品溶于pH8.0的TE缓冲液中，4℃或-20℃保存， -70℃冰箱可保存数年。
➢TE的pH为8.0时，DNA的脱氨反应减少，pH低7.0时 DNA易变性
➢分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白质分 开，同时避免核酸降解。
（三）核酸的分离纯化
应该清除的杂质主要包括: 1.非核酸的大分子污染物
蛋白质、多糖及脂类物质等大分子物质 2.非目的的核酸分子
分离某一核酸分子时，其它核酸皆为杂质 3.加入的有机溶剂和某些金属离子
核酸分离纯化的基本方法
1.加入浓盐溶液（如NaCl）
（一）保持核酸分子一级结构的完整性
4.RNA酶（RNAase)抑制剂 （3) 肝素 （4）复合硅酸盐（Macaloid) （5）RNase阻抑蛋白（RNasin） （6）氧钒核糖核苷复合物 (Vanadyl-Ribonucleoside
Complex, VRC)
一、核酸分离、纯化原则
(二)尽量排除其它分子的污染，保证核酸样品的纯度 纯化的核酸样品不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂 或过高浓度的金属离子，蛋白质、脂类、多糖分子的 污染应降低到最低程度；无其它核酸分子的污染，如 提DNA分子时，应去除RNA分子。
➢ 核酸-蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力，使氢键破坏，核蛋 白解聚；
核酸分离纯化的基本方法
2.加入SDS
SDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，还具有使核酸从蛋白 质上游离出来的功能；
核酸分离纯化的基本方法
3.酚/氯仿抽提
➢ 细胞裂解后离心分离含核酸的水相，加入等体积的酚∶氯仿∶ 异戊醇混合液，混匀后离心分离。疏水性的蛋白质被分配至有 机相，核酸则被留于上层水相。
(2）安全操作 酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时应戴手套。
（四）核酸的浓缩、沉淀与洗涤
沉淀是浓缩核酸最常用的方法。 优点： ①改变核酸的溶解缓冲液； ②重新调整核酸的浓度，提高样品浓度； ③去除溶液中某些盐离子与杂质。
（四）核酸的浓缩、沉淀与洗涤
❖ 沉淀的方法：
常用的盐类:醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵、氯化钠、氯化钾及
化和浓缩DNA。
（四）核酸的浓缩、沉淀与洗涤
核酸沉淀的温度和时间
一般强调，核酸沉淀在低温长时间下进行。低温长时间沉淀， 易导致盐与DNA共沉淀，影响以后的实验。一般使用0℃冰水， 10-15min， DNA样品足可达到实验要求。
（五）核酸的鉴定与保存
1.核酸的鉴定 ①浓度鉴定 ②纯度鉴定 ③完整性鉴定
（五）核酸的鉴定与保存
①浓度鉴定 ➢ 紫外分光光度法：核酸分子中的碱基具有共轭双键
结构，可以吸收紫外线，其最大吸收波长为260nm。
前提：核酸样品要较纯，无显著蛋白质、酚、琼脂糖及其他 核酸污染。测定浓度应大于0.25μg/ml 。
结论：在波长260nm紫外光下，1OD值的吸光度相当于双链 DNA浓度为50μg/ml；单链DNA为37 μg/ml；RNA为40 ug/ml。
(2）阴离于型表面活性剂：
如SDS，该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还能使蛋白质变性， 并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物，该复合物在高盐溶液中 沉淀。
（一）保持核酸分子一级结构的完整性
4.RNA酶（RNAase)抑制剂 RNAase分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、耐
酸、耐碱，不易失活，所以生物降解是RNA提取过程 中的主要危害因素。 (1) 皂土（bentonite ） 作用机制：皂土带负电荷，能吸附RNase，使其失活。
氯化镁。
常用的有机溶剂:乙醇、当分异核子丙酸呈醇溶多和液聚聚的阴乙离p二H子值醇状大态于，4时它，与核一酸
❖ 洗涤：核酸沉淀常常含价有有D或机少NA二溶量不价剂共溶阳中沉于离不淀乙子溶的醇形解盐等成，，有的也需机盐不用溶在会7剂0许被%，～多有75%
的乙醇洗涤去除。
机因溶此剂可变以性通。过乙醇沉淀来纯
➢比值降低：蛋白质污染（280）、酚污染（270） ➢比值升高：DNA变性、RNA污染 ➢混合污染：比值正常
（五）核酸电泳可判定核酸制品的
纯度。
（五）核酸的鉴定与保存
③ 完整性鉴定
琼脂糖凝胶电泳： ❖ 以EB为示踪剂的核酸凝胶电泳可判定核酸制品的完整
（二）细胞的破碎——核酸的释放
➢破碎细胞的方法有三种： ❖①机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法； ❖②化学试剂法：用SDS处理细胞，SDS可溶解细胞膜、
核膜，去除脂质和蛋白质，并使组织蛋白与DNA分离； ❖③酶解法：加入溶菌酶或蛋白酶，都可使细胞膜破
裂，核酸释放。蛋白酶还能降解与核酸结合的蛋白质， 促进核酸分离。
的—级结构还决定其高级结构的形式以及和其他生 物大分子结合的方式。
（一）保持核酸分子一级结构的完整性
2. 实验过程中，应注意以下条件及要求：
1）减少化学因素对核酸的降解:pH4-10 2）减少物理因素对核酸的机械剪切力：0-4C
强烈振荡、搅拌，细胞突置于低渗液中，细胞裂解，反复 冻贮等造成的机械剪切力等条件都能明显破坏大分子量的线性 DNA分子，对于分子量小的环状质粒DNA及RNA分子，威胁相对小 一些；另外如高温加热，除高温本身对核酸分子中的化学键的 破坏作用外，还可能因煮沸带来液体剪切力，因此核酸提取常 常在0～4℃的条件下进行。
性； ❖ 根据电泳条带的数目、位置和形状判定，RNA分子可以
通过荧光强度强弱来判定有无降解。 ❖ 基因组DNA如果发生降解，电泳图呈拖尾状。
（五）核酸的鉴定与保存
DNA的降解
（五）核酸的鉴定与保存
③ 完整性鉴定
完整的或降解很少的总RNA电泳图谱中，原核生 物5S、16S、23S三条带；真核生物：5S和5.8S、 18S、28S三条带；而且三条带荧光强度应呈特定的 比值。 ❖ 沉降系数大，电泳迁移率低，荧光强度高 ❖ 沉降系数小，电泳迁移率高，荧光强度低
➢ 在含核酸的水相中加入醋酸钾或醋酸钠，形成核酸盐，核酸盐 可被一些有机溶剂沉淀，离心得到的核酸可以用70%乙醇洗 涤以除去多余的盐分，即可获得一定纯度的核酸。
核酸分离纯化的基本方法
➢ 酚／氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑 制作用。
➢ 氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中 的酚，同时氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。
（五）核酸的鉴定与保存
①浓度鉴定
➢ 荧光光度法：核酸的荧光染料溴化乙锭嵌入碱基平面后，本 身无荧光的核酸在UV 激发下发出红色荧光。荧光强度的强 度与溶液中核酸的含量呈正比。 使用一系列已知的不同浓 度DNA溶液作标准对照，可比较出被测DNA溶液浓度。
➢ 注意：此法的比较主要基于目测，是估计水平。
二、分离提取核酸的主要步骤
I.材料与方法的选择 破碎组织细胞 II.破碎细胞或包膜－核酸的释放
提取 纯化
III.核酸分离、纯化 IV.核酸的浓缩、沉淀、洗涤,并去除杂质 V.核酸的鉴定与保存
（一）材料与方法的选择
➢临床常见的标本有血液、尿液、唾液、组织及体外培养的细 胞等都可作为提取核酸的原料，具体实验材料的选择应根据 实验的目的来确定。
（二）细胞的破碎——核酸的释放
注意：
1.细胞破碎方法中机械剪切法不能用于基因组DNA的 提取；
2.非机械法常用化学试剂或酶细胞溶解法。
（三）核酸的分离纯化
➢细胞裂解物是含核酸分子的复杂混合物，核酸分子 本身可能仍与蛋白质结合在一起。
➢核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力(核酸 与碱性蛋白的结合)、氢键和非极性的范德华力。
➢不同的研究目的对核酸的完整性、纯度、产量及浓度有不同的 要求。 需考虑制备核酸所需的时间与成本：简便快速、安全、经济； 应选择安全的试剂与制备方案：完整性、产量、纯度和浓度符 合实验要求。
（一）材料与方法的选择
➢临床常见的标本有血液、尿液、唾液、组织及体外培养的细 胞等都可作为提取核酸的原料，具体实验材料的选择应根据 实验的目的来确定。
EB与DNA的结合
（五）核酸的鉴定与保存
②纯度鉴定
紫外分光光度法： 主要通过A260与A280的比值来判定有无蛋白质的
污染。比值升高或降低均提示制备的核酸纯度不佳。
（五）核酸的鉴定与保存
②纯度鉴定
判断核酸样品的纯度： DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8 RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0
测定结果分析
A：测DNA：
纯的DNA样品OD260/OD280应为1.8，OD260m／ OD230应大于2.0。 1) OD260/OD280大于1.9时，表明有RNA污染。 2) 小于1.6时，表明样品中存在蛋白质或酚污染； 3) OD260/OD230小于2.0时，表明溶液中有残存的盐和 小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。
➢ RNA核蛋白和DNA核蛋白在不同浓度氯化钠溶液中的溶解度有 显著区别。
➢ DNA核蛋白在0.14mol/L 氯化钠中溶解度低，但在1–2mol/L 氯化钠中溶解度高；RNA核蛋白在0.14 mol/L氯化钠中溶解度 仍有相当大的溶解度。调节氯化钠浓度，可使RNA核蛋白和 DNA核蛋白分步提取开来。
（一）保持核酸分子一级结构的完整性
4.RNA酶（RNAase)抑制剂 (2) DEPC(二乙基焦碳酸盐) (C2H5OCOOCOOC2H5)
粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。 作用机制：与蛋白质中His结合使蛋白变性。 使用注意：
① DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。但浓度比使蛋 白质变性的浓度大100～1000倍。 ② 容易降解，保存在4℃或液氮中； ③ 提RNA时，0.1% DEPC浸泡器皿37℃ 2 h。 ④ 剧毒。
核酸分离纯化-经典版
概述
✓ 核酸（nucleic acid）是遗传信息的携带者，是基因 表达的物质基础。
✓ 无论是进行核酸结构还是功能研究，首先需要对核 酸进行分离和纯化。
✓ 核酸样品质量将直接关系到实验的成败。
一、核酸分离、纯化原则
（一）保持核酸分子一级结构的完整性 1.意义：遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸
➢ 在酚/氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为防止起泡和促使 水相与有机相的分离，再加上一定量的异戊醇（酚：氯：异 戊醉=25：24：1）。
核酸分离纯化的基本方法
使用酚时应注意
(1）使用注意 酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉红色或黄色，表明 其中含有酚的氧化产物，例如醌、二酸等。变色的酚不能用于核 酸抽提实验，因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。
（五）核酸的鉴定与保存
❖28S（或23S）RNA的荧 光强度一般约为18S （或16S）RNA的2倍， 否则提示有RNA的降解；
❖若在点样孔附近有着 色条带，提示可能存 在DNA的污染。
（五）核酸的鉴定与保存
2. 核酸的保存——DNA的保存
核酸保存的主要条件是温度和介质
➢ 温度： 4℃ 样品经常使用 -70℃是长期保存的良好温度，为一次性保存 -20℃保存,避免反复冻融
➢不同的研究目的对核酸的完整性、纯度、产量及浓度有不同的 要求。 需考虑制备核酸所需的时间与成本：简便快速、安全、经济； 应选择安全的试剂与制备方案：完整性、产量、纯度和浓度符 合实验要求。
（二）细胞的破碎——核酸的释放
➢DNA和RNA均位于细胞内（病毒除外），因此核酸分离与纯化 的第一步即是裂解细胞、释放核酸。
（一）保持核酸分子一级结构的完整性
3）抑制DNase或RNase的活性：
所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑 制剂。
4）简化步骤，缩短时间，减少破坏。
（一）保持核酸分子一级结构的完整性
3.DNA酶抑制剂
(1）金属离子螯合剂：
DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金属二价离 子螯合剂，可抑制DNA酶活性。如EDTA、柠檬酸盐络合Mg2+、Ca2+ 等离子。
（五）核酸的鉴定与保存
2. 核酸的保存——RNA的保存
➢RNA样品溶于0.3 mol/L NaAc (pH5.2)或双蒸灭菌 水中，-70℃保存 ➢长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中; ➢在RNA溶液中，加1滴0.2 mol/L VRC(氧钒核糖核苷 复合物)冻贮于-70℃,可保存数年。
➢ 保存介质： 灭菌水 TE缓冲溶液(最常用)： 10mmol/L Tris-Cl pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0
（五）核酸的鉴定与保存
2. 核酸的保存——DNA的保存
➢DNA样品溶于pH8.0的TE缓冲液中，4℃或-20℃保存， -70℃冰箱可保存数年。
➢TE的pH为8.0时，DNA的脱氨反应减少，pH低7.0时 DNA易变性
➢分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白质分 开，同时避免核酸降解。
（三）核酸的分离纯化
应该清除的杂质主要包括: 1.非核酸的大分子污染物
蛋白质、多糖及脂类物质等大分子物质 2.非目的的核酸分子
分离某一核酸分子时，其它核酸皆为杂质 3.加入的有机溶剂和某些金属离子
核酸分离纯化的基本方法
1.加入浓盐溶液（如NaCl）
（一）保持核酸分子一级结构的完整性
4.RNA酶（RNAase)抑制剂 （3) 肝素 （4）复合硅酸盐（Macaloid) （5）RNase阻抑蛋白（RNasin） （6）氧钒核糖核苷复合物 (Vanadyl-Ribonucleoside
Complex, VRC)
一、核酸分离、纯化原则
(二)尽量排除其它分子的污染，保证核酸样品的纯度 纯化的核酸样品不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂 或过高浓度的金属离子，蛋白质、脂类、多糖分子的 污染应降低到最低程度；无其它核酸分子的污染，如 提DNA分子时，应去除RNA分子。
➢ 核酸-蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力，使氢键破坏，核蛋 白解聚；
核酸分离纯化的基本方法
2.加入SDS
SDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，还具有使核酸从蛋白 质上游离出来的功能；
核酸分离纯化的基本方法
3.酚/氯仿抽提
➢ 细胞裂解后离心分离含核酸的水相，加入等体积的酚∶氯仿∶ 异戊醇混合液，混匀后离心分离。疏水性的蛋白质被分配至有 机相，核酸则被留于上层水相。
(2）安全操作 酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时应戴手套。
（四）核酸的浓缩、沉淀与洗涤
沉淀是浓缩核酸最常用的方法。 优点： ①改变核酸的溶解缓冲液； ②重新调整核酸的浓度，提高样品浓度； ③去除溶液中某些盐离子与杂质。
（四）核酸的浓缩、沉淀与洗涤
❖ 沉淀的方法：
常用的盐类:醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵、氯化钠、氯化钾及
化和浓缩DNA。
（四）核酸的浓缩、沉淀与洗涤
核酸沉淀的温度和时间
一般强调，核酸沉淀在低温长时间下进行。低温长时间沉淀， 易导致盐与DNA共沉淀，影响以后的实验。一般使用0℃冰水， 10-15min， DNA样品足可达到实验要求。
（五）核酸的鉴定与保存
1.核酸的鉴定 ①浓度鉴定 ②纯度鉴定 ③完整性鉴定
（五）核酸的鉴定与保存
①浓度鉴定 ➢ 紫外分光光度法：核酸分子中的碱基具有共轭双键
结构，可以吸收紫外线，其最大吸收波长为260nm。
前提：核酸样品要较纯，无显著蛋白质、酚、琼脂糖及其他 核酸污染。测定浓度应大于0.25μg/ml 。
结论：在波长260nm紫外光下，1OD值的吸光度相当于双链 DNA浓度为50μg/ml；单链DNA为37 μg/ml；RNA为40 ug/ml。
(2）阴离于型表面活性剂：
如SDS，该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还能使蛋白质变性， 并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物，该复合物在高盐溶液中 沉淀。
（一）保持核酸分子一级结构的完整性
4.RNA酶（RNAase)抑制剂 RNAase分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、耐
酸、耐碱，不易失活，所以生物降解是RNA提取过程 中的主要危害因素。 (1) 皂土（bentonite ） 作用机制：皂土带负电荷，能吸附RNase，使其失活。
氯化镁。
常用的有机溶剂:乙醇、当分异核子丙酸呈醇溶多和液聚聚的阴乙离p二H子值醇状大态于，4时它，与核一酸
❖ 洗涤：核酸沉淀常常含价有有D或机少NA二溶量不价剂共溶阳中沉于离不淀乙子溶的醇形解盐等成，，有的也需机盐不用溶在会7剂0许被%，～多有75%
的乙醇洗涤去除。
机因溶此剂可变以性通。过乙醇沉淀来纯
➢比值降低：蛋白质污染（280）、酚污染（270） ➢比值升高：DNA变性、RNA污染 ➢混合污染：比值正常
（五）核酸电泳可判定核酸制品的
纯度。
（五）核酸的鉴定与保存
③ 完整性鉴定
琼脂糖凝胶电泳： ❖ 以EB为示踪剂的核酸凝胶电泳可判定核酸制品的完整
（二）细胞的破碎——核酸的释放
➢破碎细胞的方法有三种： ❖①机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法； ❖②化学试剂法：用SDS处理细胞，SDS可溶解细胞膜、
核膜，去除脂质和蛋白质，并使组织蛋白与DNA分离； ❖③酶解法：加入溶菌酶或蛋白酶，都可使细胞膜破
裂，核酸释放。蛋白酶还能降解与核酸结合的蛋白质， 促进核酸分离。
的—级结构还决定其高级结构的形式以及和其他生 物大分子结合的方式。
（一）保持核酸分子一级结构的完整性
2. 实验过程中，应注意以下条件及要求：
1）减少化学因素对核酸的降解:pH4-10 2）减少物理因素对核酸的机械剪切力：0-4C
强烈振荡、搅拌，细胞突置于低渗液中，细胞裂解，反复 冻贮等造成的机械剪切力等条件都能明显破坏大分子量的线性 DNA分子，对于分子量小的环状质粒DNA及RNA分子，威胁相对小 一些；另外如高温加热，除高温本身对核酸分子中的化学键的 破坏作用外，还可能因煮沸带来液体剪切力，因此核酸提取常 常在0～4℃的条件下进行。
性； ❖ 根据电泳条带的数目、位置和形状判定，RNA分子可以
通过荧光强度强弱来判定有无降解。 ❖ 基因组DNA如果发生降解，电泳图呈拖尾状。
（五）核酸的鉴定与保存
DNA的降解
（五）核酸的鉴定与保存
③ 完整性鉴定
完整的或降解很少的总RNA电泳图谱中，原核生 物5S、16S、23S三条带；真核生物：5S和5.8S、 18S、28S三条带；而且三条带荧光强度应呈特定的 比值。 ❖ 沉降系数大，电泳迁移率低，荧光强度高 ❖ 沉降系数小，电泳迁移率高，荧光强度低
➢ 在含核酸的水相中加入醋酸钾或醋酸钠，形成核酸盐，核酸盐 可被一些有机溶剂沉淀，离心得到的核酸可以用70%乙醇洗 涤以除去多余的盐分，即可获得一定纯度的核酸。
核酸分离纯化的基本方法
➢ 酚／氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑 制作用。
➢ 氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中 的酚，同时氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。
（五）核酸的鉴定与保存
①浓度鉴定
➢ 荧光光度法：核酸的荧光染料溴化乙锭嵌入碱基平面后，本 身无荧光的核酸在UV 激发下发出红色荧光。荧光强度的强 度与溶液中核酸的含量呈正比。 使用一系列已知的不同浓 度DNA溶液作标准对照，可比较出被测DNA溶液浓度。
➢ 注意：此法的比较主要基于目测，是估计水平。
二、分离提取核酸的主要步骤
I.材料与方法的选择 破碎组织细胞 II.破碎细胞或包膜－核酸的释放
提取 纯化
III.核酸分离、纯化 IV.核酸的浓缩、沉淀、洗涤,并去除杂质 V.核酸的鉴定与保存
（一）材料与方法的选择
➢临床常见的标本有血液、尿液、唾液、组织及体外培养的细 胞等都可作为提取核酸的原料，具体实验材料的选择应根据 实验的目的来确定。
（二）细胞的破碎——核酸的释放
注意：
1.细胞破碎方法中机械剪切法不能用于基因组DNA的 提取；
2.非机械法常用化学试剂或酶细胞溶解法。
（三）核酸的分离纯化
➢细胞裂解物是含核酸分子的复杂混合物，核酸分子 本身可能仍与蛋白质结合在一起。
➢核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力(核酸 与碱性蛋白的结合)、氢键和非极性的范德华力。
➢不同的研究目的对核酸的完整性、纯度、产量及浓度有不同的 要求。 需考虑制备核酸所需的时间与成本：简便快速、安全、经济； 应选择安全的试剂与制备方案：完整性、产量、纯度和浓度符 合实验要求。
（一）材料与方法的选择
➢临床常见的标本有血液、尿液、唾液、组织及体外培养的细 胞等都可作为提取核酸的原料，具体实验材料的选择应根据 实验的目的来确定。
EB与DNA的结合
（五）核酸的鉴定与保存
②纯度鉴定
紫外分光光度法： 主要通过A260与A280的比值来判定有无蛋白质的
污染。比值升高或降低均提示制备的核酸纯度不佳。
（五）核酸的鉴定与保存
②纯度鉴定
判断核酸样品的纯度： DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8 RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0
测定结果分析
A：测DNA：
纯的DNA样品OD260/OD280应为1.8，OD260m／ OD230应大于2.0。 1) OD260/OD280大于1.9时，表明有RNA污染。 2) 小于1.6时，表明样品中存在蛋白质或酚污染； 3) OD260/OD230小于2.0时，表明溶液中有残存的盐和 小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。
➢ RNA核蛋白和DNA核蛋白在不同浓度氯化钠溶液中的溶解度有 显著区别。
➢ DNA核蛋白在0.14mol/L 氯化钠中溶解度低，但在1–2mol/L 氯化钠中溶解度高；RNA核蛋白在0.14 mol/L氯化钠中溶解度 仍有相当大的溶解度。调节氯化钠浓度，可使RNA核蛋白和 DNA核蛋白分步提取开来。
（一）保持核酸分子一级结构的完整性
4.RNA酶（RNAase)抑制剂 (2) DEPC(二乙基焦碳酸盐) (C2H5OCOOCOOC2H5)
粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。 作用机制：与蛋白质中His结合使蛋白变性。 使用注意：
① DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。但浓度比使蛋 白质变性的浓度大100～1000倍。 ② 容易降解，保存在4℃或液氮中； ③ 提RNA时，0.1% DEPC浸泡器皿37℃ 2 h。 ④ 剧毒。
核酸分离纯化-经典版
概述
✓ 核酸（nucleic acid）是遗传信息的携带者，是基因 表达的物质基础。
✓ 无论是进行核酸结构还是功能研究，首先需要对核 酸进行分离和纯化。
✓ 核酸样品质量将直接关系到实验的成败。
一、核酸分离、纯化原则
（一）保持核酸分子一级结构的完整性 1.意义：遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸
➢ 在酚/氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为防止起泡和促使 水相与有机相的分离，再加上一定量的异戊醇（酚：氯：异 戊醉=25：24：1）。
核酸分离纯化的基本方法
使用酚时应注意
(1）使用注意 酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉红色或黄色，表明 其中含有酚的氧化产物，例如醌、二酸等。变色的酚不能用于核 酸抽提实验，因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。
（五）核酸的鉴定与保存
❖28S（或23S）RNA的荧 光强度一般约为18S （或16S）RNA的2倍， 否则提示有RNA的降解；
❖若在点样孔附近有着 色条带，提示可能存 在DNA的污染。
（五）核酸的鉴定与保存
2. 核酸的保存——DNA的保存
核酸保存的主要条件是温度和介质
➢ 温度： 4℃ 样品经常使用 -70℃是长期保存的良好温度，为一次性保存 -20℃保存,避免反复冻融
➢不同的研究目的对核酸的完整性、纯度、产量及浓度有不同的 要求。 需考虑制备核酸所需的时间与成本：简便快速、安全、经济； 应选择安全的试剂与制备方案：完整性、产量、纯度和浓度符 合实验要求。
（二）细胞的破碎——核酸的释放
➢DNA和RNA均位于细胞内（病毒除外），因此核酸分离与纯化 的第一步即是裂解细胞、释放核酸。
（一）保持核酸分子一级结构的完整性
3）抑制DNase或RNase的活性：
所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑 制剂。
4）简化步骤，缩短时间，减少破坏。
（一）保持核酸分子一级结构的完整性
3.DNA酶抑制剂
(1）金属离子螯合剂：
DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金属二价离 子螯合剂，可抑制DNA酶活性。如EDTA、柠檬酸盐络合Mg2+、Ca2+ 等离子。