小鼠乳鼠培养方法 Microsoft Word 文档

小鼠乳鼠心肌细胞培养
物品：手术器械（眼科剪2把、眼科镊2把、手术镊1把）、培养皿4个、小烧杯2个、离心管4个、200目筛网、6孔板、垃圾桶、一次性吸管、加液枪（配各型号枪头）、75%酒精试剂：D-Hanks液2瓶（其中一瓶在操作前37℃预热）、2.5％胰酶消化液、加有FBS（浓度为10％）的DMEM培养基、Brdu、1％明胶、0.4％台盼蓝液
操作程序：
1、将备用物品（手术器械、培养皿、烧杯、离心管、200目筛网）进行高压灭菌
2、用酒精擦拭层流台，将高压灭菌后的物品放入层流台，紫外线消毒30分钟
3、将1％明胶加入六孔板中（每孔1ml）
4、用镊子夹住小鼠颈部将小鼠在酒精中浸泡两次，每次2-3秒
5、将消毒后的小鼠放入培养皿中，用剪刀将小鼠头部剪去，并将胸部剪开暴露出心脏，用另一个剪刀将小鼠心脏剪下放入装有预冷的D-Hanks液的培养皿中，将心脏剪开清洗残留的血液。

6、将心肌组织转移至另一个装有预冷的D-Hanks液的培养皿中进一步剪碎心脏后，加入等体积的2.5％胰酶。

7、将心肌组织转移至离心管中，反复吹打10min,静置2min后，弃上清。

8、再次加入D-Hanks液和等体积的2.5％胰酶，常温下反复吹打10min，静置2min后将上层液转移至100ml容器中，加入含10%FBS的M199培养基或DMEM培养基终止消化
9、重复上一步骤至组织完全消化，适当控制消化时间
10、用200目筛网过滤得到细胞混悬液，转移至10ml离心管。

11、以300g室温离心5min
12、弃去上清后加入DMEM+Brdu培养基吹打，转移至50ml培养瓶中后放入37℃ 5% CO2培养箱进行差速贴壁1h
13、将六孔板中的明胶吸出
14、计数心肌细胞
15、按六孔板细胞数（4~5×105个/每孔）加入细胞悬液，并添加M199+Brdu培养基或DMEM+Brdu培养基至3ml
16、至置培养箱37℃5% CO2培养箱培养。

17、24h后换液，培养基改用不含5-BdrU的培养基继续观察培养。