Taq DNA聚合酶的热纯化制备

Taq DNA聚合酶的热纯化制备
丁燕华;刘树涛;齐庆远
【摘要】[ Objective ] The paper was to improve the preparation efficacy of Taq DNA polymerase. [ Method ] Ni column was used to purify Taq DNA polymerase carrying with 6xHis tag, and recombined vector. Using the thermal -resistant characteristics of TaqDNA polymerase, the crude extract was treated at 75 ℃ for 1 h, and the activity of prepared enzyme solution was verified by PCR test. [ Result] The recombinant pET-32A-Taq could highly express in BL21 (DE3) host bacteria and remove hybrid protein by thermal denaturation. The enzyme preparation with the activity further higher than purchased TaqDNA polymerase was obtained. [ Conclusion ] Taq DNA polymerase prepared by thermal purification method is simple with low cost, and can meet the needs of a large number of conventional PCR amplification.%[目的]提高Taq DNA聚合酶的制备效率.[方法]利用Ni柱亲和色谱纯化载有6xHis标记的Taq DNA聚合酶,并重组载体,利用Taq DNA聚合酶的耐热特性,对粗提液75℃处理1h,之后通过PCR试验验证制备酶液的活力.[结果]所获重组的pET-32A-Taq能够在BL21(DE3)宿主菌中高效表达并可通过热变性去除杂蛋白,获得了活力远高于购买的Taq DNA聚合酶的酶制剂.[结论]使用热纯化法制备的Taq DNA聚合酶工艺简单,成本较低,能满足常规大量PCR实验要求.【期刊名称】《安徽农业科学》
【年(卷),期】2011(039)017
【总页数】3页(P10153-10155)
【关键词】Taq DNA聚合酶;热纯化;pET-32A;BL21(DE3)
【作者】丁燕华;刘树涛;齐庆远
【作者单位】浙江师范大学化学与生命科学学院,浙江,金华,321004;浙江师范大学
化学与生命科学学院,浙江,金华,321004;浙江师范大学化学与生命科学学院,浙江,金华,321004
【正文语种】中文
【中图分类】Q786
Taq DNA聚合酶由水生嗜热菌(Thermus aquatics)YT-1菌株中分离而得。

该菌
由Brock[1]从美国黄石公园温泉中分离，作为嗜热杆菌的标准菌株，其生长温度
为70～75℃。

1988年Saiki等[2－3]从美国黄石国家森林公园火山温泉中分离的另1株水生嗜
热杆菌(Thermus aquaticus)中提取了1种耐热DNA聚合酶，比活为20万
U/mg的纯酶，分子量为93 910 D。

与大肠杆菌聚合酶I Klenow片段相比[4]，
该酶具有以下特点:①耐高温。

在70℃下反应2 h后其残留活性大于原来的90%，在93℃下反应2 h后其残留活性是原来的60%，在95℃下反应2 h后其残留活
性是原来的40%。

②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。

③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0 kb)[5]。

由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。

为与大肠杆菌聚合酶I Klenow片段区别，将该酶命名为Taq DNA聚合酶(Taq DNA Polymerase)，它
只有1个亚基。

用Taq DNA聚合酶代替大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，是使PCR普及应用的关键。

Taq DNA聚合酶增进了PCR的特异性、产量和敏感
度。

Taq DNA聚合酶的发现使PCR得以广泛的应用[6]，Taq DNA聚合酶现已可用基因重组的方法生产，但其制备效率仍有待提高。

为此，笔者将Taq DNA聚合酶基因插入6xHis标记的pET-32A载体，并以pET-32A/BL21(DE3)为表达体系，利用Taq DNA聚合酶的耐热特性，以简单和低廉的热处理工艺，获得了可替代商品Taq DNA聚合酶的酶制剂。

1 材料与方法
1.1 材料 BL21(DE3)实验室自备，表达载体pET-32A由其他实验室提供，用于PCR反应的dNTPs、商品Taq DNA聚合酶及DNA Marker均购自宝生物工程(大连)有限公司，质粒抽提与纯化试剂盒购于OMEGA公司，SDS-PAGE低分子
量标准蛋白质购于北京科百奥生物技术有限公司。

1.2 Taq DNA聚合酶表达载体构建利用引物(5'-GGGGGAATTCCTGCCCCTCTTTGAGCCCAA-3'，5'-GGGGGCGGCCGCTCACTCCTTGGCGGAGAGCC-3')，扩增出2 493 bp的片段，PCR产物经过限制性内切酶EcoR I和NotI酶切后，连接到经过EcoR I和NotI
酶切过的pET-32A载体上，将连接质粒转化入E.coli BL21(DE3)，通过质粒筛选
即获得生产重组Taq DNA聚合酶的工程菌株。

1.3 Taq DNA聚合酶基因的诱导表达取1个已转化的阳性单克隆，转接于氨苄青霉素浓度为100 μg/ml的5 ml LB液体培养基，37℃、250 r/min培养12 h活
化转化细胞。

再取100 μl培养液，转接到氨苄青霉素浓度为200 μg/ml的100
ml LB液体培养基，37℃、250 r/min振荡培养2 h(OD600=0.4)后，加入100
μl IPTG(1 mol/L)，37 ℃250 r/min 振荡培养16 h，诱导Taq DNA聚合酶基因
的表达。

1.4 Taq DNA聚合酶的提取与纯化
(1)将培养液转入50 ml离心管4℃，8 000 r/min离心20 min。

(2)弃去上清液，加入3 ml缓冲液A[Tris-HCl(pH 7.9)50 mmol/L、Dextrose 50 mmol/L、EDTA 1 mmol/L]，用振荡器将沉淀完全悬浮于缓冲液A中。

(3)完全悬浮后再加入4 mg/ml溶菌酶。

(4)加入溶菌酶后置于室温中15～20 min。

(5)静置后在离心管中加入3 ml缓冲液B[Tris-HCl(pH 7.9)50 mmol/L、KCl 50 mmol/L、EDTA 1 mmol/L、NP-40 0.5%、Tween-20 0.5%]。

(6)75℃水浴60 min。

(7)4 ℃、12 000 g离心10 min。

(8)吸取上清液注入另一50 ml离心管中，加入6 ml含50%甘油的保存缓冲液[Tris-HCl(pH8.0)50 mmol/L、NaCl 100 mmol/L、EDTA 0.1 mmol/L、DTT
0.5 mmol/L、Triton-x100 1%]。

(9)在上面的离心管中加入12 ml含75%甘油的保存缓冲液。

1.5 Taq DNA聚合酶总活力的测定将该试验制得的Taq DNA聚合酶与实验室的
商品酶同时作PCR反应，比较自制酶与商品酶的酶活力。

(1)以质粒pUC18-T为模板(分子量为3.0 kb)，采用的引物为:P1，5'-GATAAACGACGGCCAGT-3';P2，5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'。

(2)PCR 反应体系(25 μl):dNTP 4 μl，Mg2+4 μl，PCR Buffer 5 μl，模板 DNA 1 μl，引物5'2 μl，引物3'2 μl，Taq 酶适量，加无菌水补齐。

(3)PCR参数:95℃预变性5 min;95℃变性50 s，48℃退火50 s，72℃延伸2 min，35个循环;72℃延伸5 min。

PCR产物于0.8%的琼脂糖凝胶进行电泳。

2 结果与分析
2.1 Taq DNA聚合酶表达载体构建 PCR以T.aquaticus基因组DNA为模板，扩
增出2 493 bp的DNA片段，经测序确证该片段为Taq DNA聚合酶基因。

将该
片段通过限制性内切酶EcoR I和NotI酶切后，连接到EcoR I和NotI酶切pET-
32A载体(图1)。

2.2 Taq DNA聚合酶基因在大肠杆菌中的表达氨苄青霉素阳性克隆发酵后抽提质粒，经限制性内切酶EcoR I和NotI双切，用0.8%琼脂糖电泳检测，如图2所示2 493 bp的Taq基因片段。

重组质粒经双向测序确证为Taq DNA聚合酶的重组载体，测序结果如图3。

2.3 Taq DNA聚合酶的提取与纯化 TaqDNA聚合酶在诱导表达过程中，IPTG浓度和诱导时间是影响表达量的关键因素。

在该试验的表达体系中，1 mmol/L的IPTG诱导16 h，获得了较高表达量。

重组Taq DNA聚合酶载体的阳性克隆，发酵后的裂解产物经75℃水浴加热1 h处理，能够明显去除杂蛋白(图4)，去除杂蛋白后，出现的蛋白分子量与已知Taq DNA聚合酶的蛋白分子量(94 kD)相吻合(图4泳道1所示)。

图1 pET-32A-Taq重组载体:Taq DNA聚合酶基因EcoR I-NotI(2 493 bp)Fig.1 Recombinant vector of pET-32A-Taq:Taq DNA polymerase gene EcoR I-NotI(2 493bp).
图2 pET-32A-Taq重组载体的EcoR I-Not I酶切琼脂糖电泳Fig.2 Electrophoresis of pET-32A-Taq restricted with EcoR INot I in 0.8%agarose gel.注:泳道1，pET-32A-Taq重组载体EcoR I-NotI酶切电泳;泳道2，250bp DNA ladder。

Note:Lane 1，pET-32A-Taq vectors digested with EcoR I and NotI;Lane 2，250bp DNA ladder.
图3 pET-32A-Taq质粒测序结果Fig.3 The sequencing result of plasmid pET-32A-Taq
2.4 Taq DNA 聚合酶总活力的测定以0.3 μl 5 U/μl的商品Taq DNA聚合酶为对照，分别用该实验室热纯化法制备的 Taq DNA 聚合酶0.20、0.15、0.1、0.08、0.05、0.30 μl进行PCR扩增(图5)。

试验结果经Quantity one
3.0软件分析，测
得该实验室热纯化制备的酶相当于购买Taq DNA聚合酶活力的(2.10 ±0.11)(P ＜0.01，n=3)倍。

注:泳道1，重组Taq DNA聚合酶克隆发酵粗提物75℃处理1 h(热纯化)，20 μl 样品上样;泳道2，重组Taq DNA 聚合酶克隆发酵粗提物，20 μl样品上样;M是低分子量标准蛋白。

Note:Lane 1，the crude extracts of cloning fermentation of recombinant Taq DNA polymerase were treated at 75℃for 1 h(thermal purification)，20 μl samples were loaded;Lane 2，the crude extracts of cloning fermentation of recombinant Taq DNA polymerase，20 μl samples were loaded;M was low molecular weight standard protein.图4 重组Taq DNA聚合酶纯化前后的SDS-PAGE比较Fig.4 SDS-PAGE comparison of recombinant Taq DNA polymerase before and after purification
图5 Taq DNA聚合酶活力测定Fig.5 Determination of enzyme activity of Taq DNA polymerase注:泳道1 ～6，0.2、0.15、0.1、0.08、0.05、0.3 μl该实验室重组热纯化法获得的Taq DNA聚合酶;泳道7，购自大连宝生物工程公司的 Taq DNA 聚合酶0.3μl(5 U/μl)。

Note:Lane 1 －6，0.2，0.15，0.1，0.08，0.05 and 0.3 μl Taq DNA polymerase obtained in laboratory by recombinant thermal purification method;lane 7，0.3μl Taq DNA polymerase(5
U/μl)purchased from TaKaRa Bio technology(Dalian)Co.，Ltd.
3 讨论
由于Taq DNA聚合酶在PCR中的广泛应用，有关Taq DNA聚合酶的制备技术一直在不断地优化提高。

为了提高该酶的特异性、表达量和酶活力，研究主要集中在酶基因本身、表达载体的构建、分离纯化方法等方面。

对酶本身的研究主要是对酶基因进行一些修饰和突变，如杜汉森等[7]对Taq DNA聚合酶进行了N端的定点诱变缺失和C端的连续缺失处理，对Taq DNA聚合酶的活性区域进行了系统
的定位并对一些位点进行突变，以进一步研究突变后的功能[8－11]。

可以通过除去或增加1到几个碱基对基因进行修饰。

在构建重组表达质粒载体时，可以选择强的启动子，也可以考虑添加1个增强子，使酶基因能高水平表达。

Engelke等[10]曾构建重组质粒pTTQ18并在大肠杆菌中表达重组Taq DNA聚合酶，纯化步骤要通过热变性杂蛋白、聚乙烯亚胺(PEI)沉淀，再经BioRex 70离子交换层析获得重组Taq DNA聚合酶纯品，为了保证酶的纯度和有更高的酶活力，可采用更简便、更有效的分离纯化方法。

该试验主要是在含有T7强启动子的PET系统进行表达，经过一步75℃热变性得到了较纯的酶，其酶活力比同类商品酶高1倍左右。

以该试验构建的表达体系，用热纯化法能够简单、经济地制备Taq DNA聚合酶，以满足大量常规PCR扩增需求。

4 结论
将Taq DNA聚合酶插入带有6xHis标记的载体pET-32A能够通过Ni柱纯化获得高纯Taq DNA聚合酶。

由于Taq DNA聚合酶具有高耐热的特性，在pET-
32A/E.coli BL21(DE3)的表达体系中，75℃水浴1 h即可有效地去除杂蛋白，制备Taq DNA聚合酶比商品Taq DNA聚合酶的酶活性高1倍。

PCR扩增试验结果显示，所制得的酶能够替代购买的Taq DNA聚合酶。

该方法简单、经济，能够满足一般PCR试验的要求。

同时，6xHis标记也为Ni柱纯化高纯度的聚合酶奠定了基础。

参考文献
[1]BROCK T D.The value of basic research:discovery of Thermus aquaticus and other extreme thermophiles[J].Genetics，1997，146(4):1207 －1210.
[2]SAIKI R K，GELFAND D H，STOFTEL S，et al.Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase[J].Science，1988，239(1):487 －491.
[3]SAIKI R K，SCARF S，FALOONA F，et al.Enzymatic amplification of betaglobin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia[J].Science，1985，230(4732):1350 －1354.
[4]KOMBERG A，SIMMS E S.Metaphosphate synthesis by an enzyme from Escherichia coli[J].Biochim BiophysActa，1956，20(1):215 －227.
[5]AREZI B，XING W M，SORGE J A，et al.Amplification efficiency of thermostable DNA polymerases[J].Analytical Biochemistry，2003，
321(2):226－235.
[6]CLINE J，BRAMAN J C，HOGREFE H H.PCR fidelity of pfu DNA polymerise and other thermostable DNA polymerises[J].Nucleic Acids Res，1996，24(18):3546 －3551.
[7]杜汉森，季朝能，郑佐华，等.Taq DNA耐热聚合酶在大肠杆菌中的克隆和高
表达[J].生物工程学报，1996，12(4):503 －507.
[8]季朝能，杜汉森，郑佐华，等.Taq DNA聚合酶功能区域的定位[J].中国生物化
学与分子生物学报，1999，13(3):432－435.
[9]CIRINO P C，MAYER K M，UMENO D.Generating mutant libraries using error-prone PCR[J].Methods Mol Biol，2003，231:3 －9.
[10]ENGELKE D R，KRIKOS A，BRUCK M E，et al.Purification of Thermus aquaticus DNA polymerase expressed in Escherichia coli[J].Anal Biochem，1990，191(2):396 －400.
[11]BARNES W M.The fidelity of Taq polymerase catalyzing PCR is improved by an N-terminal deletion[J].Gene，1992，112(1):29 －35.。