生物制药多肽与蛋白质类药物
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• b．种子培养基 1％蛋白胨、0.5％酵母提取 物、0.5％NaCl。
• c．种子摇瓶培养 在4个1000mL三角瓶中， 分别装入250mL种子培养基，分别接种人干 扰素αⅡb基因工程菌，30℃摇床培养10h，
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• d．发酵培养基 1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、 0.01％NH4Cl、0.05％NaCl，0.6％ Na2HPO4、0.001％CaCl2、0.3％KH2PO4、 0.01％MgSO4、0.4％葡萄糖、50mg/ml氨 苄西林、少量消泡剂。
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• 沉淀4加原体积l/25000量pH=8.0的 0.1mol/L PBS溶解，调至pH=7~7.5，对 PBS(pH=7.3)透析，过夜，离心，收集上清液， 检测，得IFN-B。上清液3中加盐酸使pH值降 至3.0，离心，得沉淀5。沉淀5加入原体积 1/5000量的pH=8、0.1mol/L PBS溶解，加 NaOH调节pH=7~7.5，对PBS(pH=7.3)透 析过夜，离心收集上清液，检测，得IFN-A。 每份灰黄层约能制备100万单价的纯化干扰素。
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• 此法特点是一次纯化量大，回收率高于60％； 经济，简便，易于普及。效价可达1.2×108 U/ml，比活2.2×106 U/mg(蛋白)。IFNA中干扰素含量占回收干扰素的82％，比活 也比较高。IFN1的比活较低[5×104 U/mg (蛋白)]，一般可作外用滴鼻剂或点眼剂等。
第14页/共46页
• 将0.5µg平头末端cDNA用末端转移酶加15 个dC，并将2µg质粒pBB322在PstⅠ位点 线性化，用末端转移酶加15个dG，再将两者 连接，利用这种方法可产生新的PstⅠ位点， 利于从载体上再次切下cDNA。将产生的质 粒转化大肠杆菌HB101后，用微量板培养。 合成引物5′-CCTTCTGGAACTG- 3′，该序 列是IFN-α、β最长的不间断保守序列，用其 作引物可同时调出IFN-α、β。
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• 3.6 基因工程干扰素的生产工艺 • 制备基因工程α-干扰素的工艺流程如下：
• 下面以基因工程人干扰素αⅡb为例说明其生
产过程。
第27页/共46页
• ① 发酵
• a．生产种子 人干扰素αⅡb基因工程菌SWIFN-αⅡb／E．coli-DH5α。质粒用PL启动 子，含氨苄西林抗性基因。
胞、H淋巴细胞而进行免疫调节； • ④改变细胞表面的状态，使负电荷增加，组
织相容性抗原表达增加； • ⑤增加细胞对双链DNA的敏感性。
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• 3.4 传统方法生产干扰素 • １．传统方法生产工艺流程：利用血库血大
量制备人血细胞干扰素。
第ห้องสมุดไป่ตู้页/共46页
• ２．工艺过程及控制要点 • ① 分离灰黄层 取新鲜血液(一般每份
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• IFN-α的表达
• 用家蚕核型多角病毒BmNPV体外感染的家蚕 传代细胞株BM-N通过噬菌斑法纯化得到 BmNPV的T3亚型。利用从感染脂肪体 mRNA制得的cDNA为探针，对其多角蛋白序 列进行检验，其中10.5kb的EcoRⅠ片段及 3.9kb的HindⅢ片段可与探针杂交，将 10.5kb的EcoRⅠ片段克隆到pBR322中，产 生质粒pBmE36。对其用Hind Ⅲ 酶切，得到 3.9kb片段，其中含有多角蛋白全部序列，将 该片段插入pUC9的HindⅢ位点，产生质粒
• e．发酵 用15L发酵罐进行发酵，发酵培养基 的装量为10L，pH＝6.8，搅拌转速500 r/min，通风比为1︰1m3／(m3·min)，溶氧 为50％。30℃发酵8h，然后在42℃诱导 2~3h即可完成发酵。同时每隔不同时间取2ml
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• ② 产物的提取与纯化 • a．提取 离心,去上清液，得湿菌体。 • 湿菌体重新悬浮于磷酸缓冲液(pH＝7.0)中，
第11页/共46页
• 3.5 基因工程干扰素的生产 • 1973年Cohen将两种不同的DNA分子进
行体外重组，并用大肠杆菌表达，使大量、廉 价制备单组分干扰素成为可能。1980年和 1982年利用基因工程成功地获得了IFN-α、 IFN-β和IFN-γ的cDNA，标志着第二代干扰 素的诞生。1987年，3种干扰素的生产开始 工业化，并大量进入市场。
于冰浴条件下进行超声破碎，离心30min， 取沉淀。 • 室温搅拌抽提2h，离心，取上清液。 • 用磷酸缓冲液(pH＝7.0)稀释，加二硫基苏糖 醇至0.1mol/L，4℃搅拌15h，15000 r/min离心30min，除去不溶物。
第30页/共46页
• 上清液经截流量为104相对分子质量的中空 纤维超滤器浓缩，将浓缩的人干扰素αⅡb液 经过Sephadex G-50分离，层析柱 (2cm×100 cm)先用20mmol/L磷酸缓冲 液(pH＝7.0)平衡，上柱后用同一缓冲液洗 脱分离，收集人干扰素αⅡb部分，经SDSPAGE检查。
第24页/共46页
• 将pIFN2B310与病毒基因组DNA便可共转染 BM-N细胞系或家蚕幼体，即可得到重组病毒 BmIFN2B310、用两个噬菌斑单位的病毒感 染3×106个BM-N细胞或用50µl 3×105个噬 菌斑单位的病毒溶液注入家蚕幼体，培养24h 后收集培养液使可得到干扰素。
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• ３．表达方法 • 鼠干扰素的抗病毒活性主要位于氨基酸序列上
的10~40位、78~107位、123~166位的A、 B、C区，尤其是位于78和79位的氨基酸对抗 病毒活性十分重要。 • 人IFN-α1的121~136位对抗病毒活性作用 较大，人IFN-γ的N端10个氨基酸也是保持其 活性所必需的。 • 嵌合表达的干扰素往往优于单一干扰素。
• 另外，将pBmE36的3.1kb的Hind Ⅲ片段连 接到pUC8上，得到质粒p8H225，用EcoRⅠ 及AatⅡ切，得含有多角蛋白基因下游3.1kb 基因的3.5kb片段，将其连接列p9H18的
第23页/共46页• 将从基因中用183bp探针调出的在ATG 后含有SmaⅠ位点(即有序列CCCGGGATG) 的IFN-α-J基因片段连接到p89B310上，使 构建成质粒pIFN2B310。
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• 为进一步检测转入的质粒的准确性，还要用菌 落与原始诱导细胞中的DNA进行杂交。
• 经过以上两次杂交筛选的菌落，还要对其产物 进行定性。
• 如产物为干扰素，则说明所建立的可供以 后基因的调取使用。第18FN基因，可以
源细胞不同，分为白细胞干扰素(IFN-α)、类 淋巴细胞干扰素(IFN-α与IFN-β的混合物)、 成纤维细胞干扰素(IFN-β)、T 细胞干扰素 (IFN-γ)等几类。 • IFNα型干扰素又以其结构不同再分为 IFNαⅠb、IFNαⅡ和IFNαⅡb等亚型。
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• 3.3 干扰素的作用 • ①抑制病毒等细胞内微生物的增殖； • ②抗细胞增殖， • ③通过作用于巨噬细胞、NK细胞、T淋巴细
第1般是用诱导剂对可 以产生干扰素的肿瘤细胞株进行诱导，从中 取出mRNA，通过相应的引物对干扰素的 mRNA进行逆转录-PCR扩增，将其与一定 的质粒相连接后用合适的宿主菌进行培养、 扩增即可。
• 以从Namalva细胞中克隆IFN-α、β为例。据IFN的编码 序列人工合成的一段DNA短链或其他种属的 IFN外显子编码序列。由于IFN的种属特异性， 因此印迹的条件不能太严格，这种方法9页/共46页
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• 将p9H18用EcoRⅠ切后于50U BAL 31外切核酸酶缓冲液中23℃水浴 10min，更换缓冲液，并加入0.2倍体积的0.5mol/L EDTA终止反应。
第22页/共46页
• 将截短的p9H18片段用HindⅢ 酶切，并通过 琼脂糖凝胶电泳分离2.7kb的Hind Ⅲ平头末 端片段，将其插入pUC9即p9B310的 HindⅢ-SmaⅠ位点。
• 小心弃去上清液，再用9倍量的0.83％氯化铵 液重复处理1次，溶解残存的红细胞。
• 取沉淀的白细胞并悬于培养液中，置于冰浴， 取样作活细胞计数，用预温的培养液稀释成每 毫 升 含 1 0 7 个 活 细 胞 。 第7页/共46页
• ③ 启动诱生 取稀释的细胞悬液加入白细胞干 扰素，使其最后浓度为100µg/ml置37℃水 浴搅拌培养2h。
400ml)，加入ACD抗凝剂，离心后分离出 血浆，小心吸取灰黄层。每份血可吸取 13~15ml，放置4℃冰箱中过夜。
第6页/共46页
• ② 氯化铵处理
• 每份灰黄层加入30ml缓冲盐水，再加入9倍体 积量的冷的氯化铵溶液(0.83％)，混匀，4℃ 放置10min，然后在4℃离心(8000 r/min) 20min。
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• 将Namalva细胞用Senda病毒诱导后从上清 中用酚提取mRNA，通过oligo(dT)纤维素柱 纯化及5％~20％(W/V)蔗糖密度梯度离心 25000r/min 20 h后取6~18S的组分。用逆 转录酶合成第一条互补链后用DNA聚合酶Ⅰ 合成第二条链，用核酸酶S1切成平头末端后5 ％~20％(W/V)蔗糖密度梯度离心进行纯化， 取大于600 bp的组分。
第31页/共46页
• b．纯化 将Sephadex G-50柱分离的人干扰 素αⅡb组分，再经DE-52柱(2cm×cm)纯化， 人干扰素αⅡb组分上柱后用含0.05mol/L， 0.1mol/L，0.15mol/L NaCl的20mmol/L 磷酸缓冲液(pH＝7.0)分别洗涤，收集含人干 扰素αⅡb的洗脱液。全过程蛋白质回收率为20 ％~25％，产品不含杂蛋白、DNA及热原质。 干扰素αⅡb含量符合要求。
• 3.1 干扰素的定义 • 1980年，国际干扰素命名委员会对干扰素
下的定义为：干扰素是一种在同种细胞上具有 广谱抗病毒活性的蛋白质。现在，一般指脊椎 动物细胞受干扰素诱生剂作用后合成的一类具 有细胞功能调节作用的蛋白。
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• 3.2 分类 • 干扰素在整体上不是均一的分子，可根据其来
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• 在T4激酶的作用下，用γ-32P-ATP对其进行标记，并用Sephadex G25进行纯化。用cDNA作为引物对其进行延长，并再用Sephadex G-50 进行纯化，使可得到标记后的cDNA。
第16页/共46页
• 将微量板上的菌落转移到纤维素膜上，当菌落 直径长到2mm后与事先分离的末端标记的 cDNA 37℃杂交2d。然后用50％甲酰胺、 0.2×SSC(1×SSC为0.15mol/LNaCl， 0.015mol/L柠檬酸钠) 室温洗膜3h。在上述 杂交液中加入50 µg/ml poly(U)、10µg/ml poly(I)︰poly(C)进行杂交，用50％甲酰胺、 1×SSC洗脱后在室温干燥，并于-70℃曝光， 检测细胞中质粒与cDNA杂交的情况。
• ④ 正式诱生 启动后的白细胞加入仙台病毒 (在10天龄鸡胚中培养48~72h，收获尿囊液) 使其最后浓度为每毫升100~150血凝单位， 在37℃搅拌培养过夜。
• ⑤ 收获 将培养物离心(2500 r/min) 30min， 吸取上清液即得粗制干扰素。
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• ⑥ 纯化 将粗制人白细胞干扰素加入硫氰化钾 0.5mol/L，用2mol/L盐酸调节pH=3.5，离 心弃去上清液，得沉淀1。沉淀1加入原体积 1/5量的冷乙醇(94％)，离心弃沉淀得上清液1。 上清液1用盐酸调节pH=5.5，离心弃去沉淀， 再调至pH=5.8，离心，得上清液2和沉淀2。 沉淀2加入原体积1/50量的甘氨酸-盐酸缓冲液 (pH=2)溶解，检测，得IFN1。上清液2调节 pH值至8.0，离心弃去清液，得沉淀3。沉淀3 加入原体积1/50量的0.1mol/L PBS， 0.5mol/L硫氰化钾(pH=8)溶解，pH值降至 5.2，离心得上清液3和沉淀4。
• c．种子摇瓶培养 在4个1000mL三角瓶中， 分别装入250mL种子培养基，分别接种人干 扰素αⅡb基因工程菌，30℃摇床培养10h，
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• d．发酵培养基 1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、 0.01％NH4Cl、0.05％NaCl，0.6％ Na2HPO4、0.001％CaCl2、0.3％KH2PO4、 0.01％MgSO4、0.4％葡萄糖、50mg/ml氨 苄西林、少量消泡剂。
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• 沉淀4加原体积l/25000量pH=8.0的 0.1mol/L PBS溶解，调至pH=7~7.5，对 PBS(pH=7.3)透析，过夜，离心，收集上清液， 检测，得IFN-B。上清液3中加盐酸使pH值降 至3.0，离心，得沉淀5。沉淀5加入原体积 1/5000量的pH=8、0.1mol/L PBS溶解，加 NaOH调节pH=7~7.5，对PBS(pH=7.3)透 析过夜，离心收集上清液，检测，得IFN-A。 每份灰黄层约能制备100万单价的纯化干扰素。
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• 此法特点是一次纯化量大，回收率高于60％； 经济，简便，易于普及。效价可达1.2×108 U/ml，比活2.2×106 U/mg(蛋白)。IFNA中干扰素含量占回收干扰素的82％，比活 也比较高。IFN1的比活较低[5×104 U/mg (蛋白)]，一般可作外用滴鼻剂或点眼剂等。
第14页/共46页
• 将0.5µg平头末端cDNA用末端转移酶加15 个dC，并将2µg质粒pBB322在PstⅠ位点 线性化，用末端转移酶加15个dG，再将两者 连接，利用这种方法可产生新的PstⅠ位点， 利于从载体上再次切下cDNA。将产生的质 粒转化大肠杆菌HB101后，用微量板培养。 合成引物5′-CCTTCTGGAACTG- 3′，该序 列是IFN-α、β最长的不间断保守序列，用其 作引物可同时调出IFN-α、β。
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• 3.6 基因工程干扰素的生产工艺 • 制备基因工程α-干扰素的工艺流程如下：
• 下面以基因工程人干扰素αⅡb为例说明其生
产过程。
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• ① 发酵
• a．生产种子 人干扰素αⅡb基因工程菌SWIFN-αⅡb／E．coli-DH5α。质粒用PL启动 子，含氨苄西林抗性基因。
胞、H淋巴细胞而进行免疫调节； • ④改变细胞表面的状态，使负电荷增加，组
织相容性抗原表达增加； • ⑤增加细胞对双链DNA的敏感性。
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• 3.4 传统方法生产干扰素 • １．传统方法生产工艺流程：利用血库血大
量制备人血细胞干扰素。
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• ２．工艺过程及控制要点 • ① 分离灰黄层 取新鲜血液(一般每份
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• IFN-α的表达
• 用家蚕核型多角病毒BmNPV体外感染的家蚕 传代细胞株BM-N通过噬菌斑法纯化得到 BmNPV的T3亚型。利用从感染脂肪体 mRNA制得的cDNA为探针，对其多角蛋白序 列进行检验，其中10.5kb的EcoRⅠ片段及 3.9kb的HindⅢ片段可与探针杂交，将 10.5kb的EcoRⅠ片段克隆到pBR322中，产 生质粒pBmE36。对其用Hind Ⅲ 酶切，得到 3.9kb片段，其中含有多角蛋白全部序列，将 该片段插入pUC9的HindⅢ位点，产生质粒
• e．发酵 用15L发酵罐进行发酵，发酵培养基 的装量为10L，pH＝6.8，搅拌转速500 r/min，通风比为1︰1m3／(m3·min)，溶氧 为50％。30℃发酵8h，然后在42℃诱导 2~3h即可完成发酵。同时每隔不同时间取2ml
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• ② 产物的提取与纯化 • a．提取 离心,去上清液，得湿菌体。 • 湿菌体重新悬浮于磷酸缓冲液(pH＝7.0)中，
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• 3.5 基因工程干扰素的生产 • 1973年Cohen将两种不同的DNA分子进
行体外重组，并用大肠杆菌表达，使大量、廉 价制备单组分干扰素成为可能。1980年和 1982年利用基因工程成功地获得了IFN-α、 IFN-β和IFN-γ的cDNA，标志着第二代干扰 素的诞生。1987年，3种干扰素的生产开始 工业化，并大量进入市场。
于冰浴条件下进行超声破碎，离心30min， 取沉淀。 • 室温搅拌抽提2h，离心，取上清液。 • 用磷酸缓冲液(pH＝7.0)稀释，加二硫基苏糖 醇至0.1mol/L，4℃搅拌15h，15000 r/min离心30min，除去不溶物。
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• 上清液经截流量为104相对分子质量的中空 纤维超滤器浓缩，将浓缩的人干扰素αⅡb液 经过Sephadex G-50分离，层析柱 (2cm×100 cm)先用20mmol/L磷酸缓冲 液(pH＝7.0)平衡，上柱后用同一缓冲液洗 脱分离，收集人干扰素αⅡb部分，经SDSPAGE检查。
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• 将pIFN2B310与病毒基因组DNA便可共转染 BM-N细胞系或家蚕幼体，即可得到重组病毒 BmIFN2B310、用两个噬菌斑单位的病毒感 染3×106个BM-N细胞或用50µl 3×105个噬 菌斑单位的病毒溶液注入家蚕幼体，培养24h 后收集培养液使可得到干扰素。
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• ３．表达方法 • 鼠干扰素的抗病毒活性主要位于氨基酸序列上
的10~40位、78~107位、123~166位的A、 B、C区，尤其是位于78和79位的氨基酸对抗 病毒活性十分重要。 • 人IFN-α1的121~136位对抗病毒活性作用 较大，人IFN-γ的N端10个氨基酸也是保持其 活性所必需的。 • 嵌合表达的干扰素往往优于单一干扰素。
• 另外，将pBmE36的3.1kb的Hind Ⅲ片段连 接到pUC8上，得到质粒p8H225，用EcoRⅠ 及AatⅡ切，得含有多角蛋白基因下游3.1kb 基因的3.5kb片段，将其连接列p9H18的
第23页/共46页• 将从基因中用183bp探针调出的在ATG 后含有SmaⅠ位点(即有序列CCCGGGATG) 的IFN-α-J基因片段连接到p89B310上，使 构建成质粒pIFN2B310。
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• 为进一步检测转入的质粒的准确性，还要用菌 落与原始诱导细胞中的DNA进行杂交。
• 经过以上两次杂交筛选的菌落，还要对其产物 进行定性。
• 如产物为干扰素，则说明所建立的可供以 后基因的调取使用。第18FN基因，可以
源细胞不同，分为白细胞干扰素(IFN-α)、类 淋巴细胞干扰素(IFN-α与IFN-β的混合物)、 成纤维细胞干扰素(IFN-β)、T 细胞干扰素 (IFN-γ)等几类。 • IFNα型干扰素又以其结构不同再分为 IFNαⅠb、IFNαⅡ和IFNαⅡb等亚型。
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• 3.3 干扰素的作用 • ①抑制病毒等细胞内微生物的增殖； • ②抗细胞增殖， • ③通过作用于巨噬细胞、NK细胞、T淋巴细
第1般是用诱导剂对可 以产生干扰素的肿瘤细胞株进行诱导，从中 取出mRNA，通过相应的引物对干扰素的 mRNA进行逆转录-PCR扩增，将其与一定 的质粒相连接后用合适的宿主菌进行培养、 扩增即可。
• 以从Namalva细胞中克隆IFN-α、β为例。据IFN的编码 序列人工合成的一段DNA短链或其他种属的 IFN外显子编码序列。由于IFN的种属特异性， 因此印迹的条件不能太严格，这种方法9页/共46页
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• 将p9H18用EcoRⅠ切后于50U BAL 31外切核酸酶缓冲液中23℃水浴 10min，更换缓冲液，并加入0.2倍体积的0.5mol/L EDTA终止反应。
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• 将截短的p9H18片段用HindⅢ 酶切，并通过 琼脂糖凝胶电泳分离2.7kb的Hind Ⅲ平头末 端片段，将其插入pUC9即p9B310的 HindⅢ-SmaⅠ位点。
• 小心弃去上清液，再用9倍量的0.83％氯化铵 液重复处理1次，溶解残存的红细胞。
• 取沉淀的白细胞并悬于培养液中，置于冰浴， 取样作活细胞计数，用预温的培养液稀释成每 毫 升 含 1 0 7 个 活 细 胞 。 第7页/共46页
• ③ 启动诱生 取稀释的细胞悬液加入白细胞干 扰素，使其最后浓度为100µg/ml置37℃水 浴搅拌培养2h。
400ml)，加入ACD抗凝剂，离心后分离出 血浆，小心吸取灰黄层。每份血可吸取 13~15ml，放置4℃冰箱中过夜。
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• ② 氯化铵处理
• 每份灰黄层加入30ml缓冲盐水，再加入9倍体 积量的冷的氯化铵溶液(0.83％)，混匀，4℃ 放置10min，然后在4℃离心(8000 r/min) 20min。
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• 将Namalva细胞用Senda病毒诱导后从上清 中用酚提取mRNA，通过oligo(dT)纤维素柱 纯化及5％~20％(W/V)蔗糖密度梯度离心 25000r/min 20 h后取6~18S的组分。用逆 转录酶合成第一条互补链后用DNA聚合酶Ⅰ 合成第二条链，用核酸酶S1切成平头末端后5 ％~20％(W/V)蔗糖密度梯度离心进行纯化， 取大于600 bp的组分。
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• b．纯化 将Sephadex G-50柱分离的人干扰 素αⅡb组分，再经DE-52柱(2cm×cm)纯化， 人干扰素αⅡb组分上柱后用含0.05mol/L， 0.1mol/L，0.15mol/L NaCl的20mmol/L 磷酸缓冲液(pH＝7.0)分别洗涤，收集含人干 扰素αⅡb的洗脱液。全过程蛋白质回收率为20 ％~25％，产品不含杂蛋白、DNA及热原质。 干扰素αⅡb含量符合要求。
• 3.1 干扰素的定义 • 1980年，国际干扰素命名委员会对干扰素
下的定义为：干扰素是一种在同种细胞上具有 广谱抗病毒活性的蛋白质。现在，一般指脊椎 动物细胞受干扰素诱生剂作用后合成的一类具 有细胞功能调节作用的蛋白。
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• 3.2 分类 • 干扰素在整体上不是均一的分子，可根据其来
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• 在T4激酶的作用下，用γ-32P-ATP对其进行标记，并用Sephadex G25进行纯化。用cDNA作为引物对其进行延长，并再用Sephadex G-50 进行纯化，使可得到标记后的cDNA。
第16页/共46页
• 将微量板上的菌落转移到纤维素膜上，当菌落 直径长到2mm后与事先分离的末端标记的 cDNA 37℃杂交2d。然后用50％甲酰胺、 0.2×SSC(1×SSC为0.15mol/LNaCl， 0.015mol/L柠檬酸钠) 室温洗膜3h。在上述 杂交液中加入50 µg/ml poly(U)、10µg/ml poly(I)︰poly(C)进行杂交，用50％甲酰胺、 1×SSC洗脱后在室温干燥，并于-70℃曝光， 检测细胞中质粒与cDNA杂交的情况。
• ④ 正式诱生 启动后的白细胞加入仙台病毒 (在10天龄鸡胚中培养48~72h，收获尿囊液) 使其最后浓度为每毫升100~150血凝单位， 在37℃搅拌培养过夜。
• ⑤ 收获 将培养物离心(2500 r/min) 30min， 吸取上清液即得粗制干扰素。
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• ⑥ 纯化 将粗制人白细胞干扰素加入硫氰化钾 0.5mol/L，用2mol/L盐酸调节pH=3.5，离 心弃去上清液，得沉淀1。沉淀1加入原体积 1/5量的冷乙醇(94％)，离心弃沉淀得上清液1。 上清液1用盐酸调节pH=5.5，离心弃去沉淀， 再调至pH=5.8，离心，得上清液2和沉淀2。 沉淀2加入原体积1/50量的甘氨酸-盐酸缓冲液 (pH=2)溶解，检测，得IFN1。上清液2调节 pH值至8.0，离心弃去清液，得沉淀3。沉淀3 加入原体积1/50量的0.1mol/L PBS， 0.5mol/L硫氰化钾(pH=8)溶解，pH值降至 5.2，离心得上清液3和沉淀4。