羊口疮病毒B2L截短重组蛋白刺激小鼠产生特异性抗体的研究

中国兽医科学 2021,51(01):66-73
Chinese Veterinary Science网络首发时间：2020-12-09 D O I：10.16656/j.issn. 1673-4696.2021.0020 中图分类号：S852.659.1 文献标志码：A文章编号：1673-4696(2021)01-0066-08
羊口疮病毒B2L截短重组蛋白刺激小鼠
产生特异性抗体的研究
刘丽佳，孙正楠，向华，杨发龙，张煥容*
(西南民族大学畜牧兽医学院，四川成都610041)
摘要：为研究羊口疮病毒（〇RFV)新型亚单位疫苗，设计了 ORFVB2L优势抗原表位截短重组蛋白，命 名为HBBH并经原核表达和鉴定。

以不同剂量HBBH不加或加不同佐剂，经滴鼻或颈部皮下注射免疫 BALBA:小鼠，其中滴鼻共 4 组（HBBH 10 Mg、20 ng、30 M g和 20 Mg+LTB)，注射组（HBBH20 y g+201 佐 剂）。

同时设〇R F V组织灭活抗原+201佐剂注射免疫对照和空白对照，每组共免疫3次，每次间隔7 d。

HBBH 间接ELISA检测一免、二免、三免后7d以及三免后14d血清中ORFVIgG、IgA和三免后14d肺灌洗液 slg A的抗体水平，取不同水平的IgG ELlSA阳性血清检测细胞中和抗体效价。

结果显示，表达并鉴定了具有 良好反应原性的包含ORFVB2L蛋白优势抗原表位的戴短重组蛋白HBBH。

免疫小鼠试验结果表明，不同 剂量HBBH通过滴鼻或颈部皮下注射均可刺激小鼠产生O RFV特异性IgG抗体，20 m g HBBH+201佐剂注 射免疫能最大刺激小鼠血清IgG抗体的产生。

实验小鼠三免后14 d肺灌洗液特异性slgA仅在HBBH滴鼻 免疫剂量彡20 Mg的三个组中检测到，其中30 ng HBBH组刺激小鼠产生了最高水平的slgA。

在同为20 ng HBBH滴鼻免疫时，添加L T B佐剂刺激小鼠产生了更高水平的slgA。

表明一定剂量的HBBH+L T B佐剂滴鼻免 疫可更好地刺激小鼠产生slgA。

HBBH间接ELISA IgG阳性血清的细胞中和抗体效价可高达1: 128,且能中和 4株O RFV分离株。

结果表明，20 ngHBBH+201佐剂注射免疫3次和20 MgHBBH+L T B佐剂滴鼻免疫3 次均能刺激BALB/c小鼠产生高水平的抗O RFV血清中和抗体IgG和黏膜抗体slgA。

本研究为ORFVB2L 优势抗原表位截短重组蛋白作为亚单位疫苗提供了数据支持。

关键词：羊口疮病毒；B2L截短重组蛋白；亚单位疫苗；中和抗体；黏膜免疫
Study on specific antibody production stimulated by B2L truncated
recombinant protein of orf virus
LIU Li-jia,SUN Zheng-nan,XIANG Hua,YANG Fa-Long,ZHANG Huan-rong*
(College of A nimal Husbandry and Veterinary Medicine .Southwest Minzu University .Chengdu610041 yChina)
Abstract：In order to research the sheep aphtha virus (ORFV) new subunit vaccine. Bioinformatics software were used to analyze the immune protective antigen epitopes of ORFV B2L protein,for designing the truncated recombinant B2L antigen epitope protein containing histidine label and flexible con­necting area,the prokaryotic expression vector and recombinant ORFV truncated recombinant B2L were constructed and expressed. BALB/c mice were immunized three times with different doses of HBBH (10 pg, 20 Mg,30 ^g) without or with different adjuvants(LTB or SEPEC 201 adjuvant) through nasal drop or neck subcutaneous injection. At the same time,ORFV tissue inactivated antigen containing SEPEC 201 adju­vant were set for control. ORFV Specific serum IgG,IgA and secretary IgA(sIgA) antibody levels were de~
收稿日期：2020-09-08;修回日期：2020-11 -20
基金项目：西南民族大学研究生创新型科研项目（CX2020SZ58);西南民族大学新发动物疫病研究创新团队项目（2020NTD02) 作者简介：刘丽佳（1995-)，女，四川内江人，硕士生，主要从事动物传染病的防治研究，E-mail: *****************。

*通讯 作者：张焕容（1969-)，女，重庆人，教授，博士，研究方向为动物传染病诊断与防治，E-mail:****************。

第1期刘丽佳等：羊口疮病毒B2L截短重组蛋白刺激小鼠产生特异性抗体的研究67
tected by indirect ELISA based on ORFV B2L truncated recombinant protein HBBH. The truncated recombi­nant protein HBBH containing ORFV B2L dominant antigen epitopes were efficiently expressed,which could bind to ORFV specific antibodies,indicating that the protein had good reactivity. The results showed that different doses of HBBH could stimulate the production of ORFV specific IgG antibody in mice by nasal drop or neck subcutaneous inject ion, and 20 |^g HBBH with SEPEC 201 adjuvant could stimu­late the highest production of serum IgG antibody in mice. Lung lavage fluid specific slgA was detected only in the three groups immuned with HBBH^20 /^g of at 14 d post the third inmmune by nasal drop,among which the 30 HBBH group stimulated the highest level of slgA. When the HBBH nasal drop does were 20 /^g, the addition of LTB adjuvant stimulated mice to produce higher levels of slgA. The results showed that a certain dose of HBBH plus LTB adjuvant by nasal immunization could better stimulate the production of slgA in mice,however,the serum IgA produced by the HBBH immuned mice was maintained only for a short time. The highest titer of cell neutralizing antibody of the indrect ORFV HBBH ELISA positive IgG serum could reach 1 • 128 and neutralize the 4 ORFV isolates used in this experiment. BALB/c mice were stimu­lated to produce high levels of anti-〇RFV serum neutralizing IgG antibody by 20 HBBH with SEPEC 201 adjuvant by neck subcutaneous injection immune and that of slgA by 20 ^ g HBBH with LTB adjuvant by nasal drop immune. This study provided data support for ORFV B2L dominant antigen epitope truncated re­combinant protein as subunit vaccine.
Key words：Orf virus；B2L truncated recombinant protein；subunit vaccine；neutralizing antibody；mucosal immunity
* Corresponding author：ZHANG Huan-rong,E-mail ：727746768@qq. com
羊口疮(O R F)是由痘病毒科副痘病毒属的羊口 疮病毒（〇rfv iru s，〇R FV)引起的一种接触性、嗜上 皮性人畜共患传染病。

O R FV感染后可引起机体的 细胞免疫和体液免疫应答，体液免疫应答产生的特 异性抗体可中和ORFV。

国外倾向于使用O R FV弱毒疫苗，O R F V弱毒疫苗免疫过程类似于O R FV感 染，可引起机体的细胞免疫和体液免疫应答。

国外 文献报道，O R F V弱毒疫苗仅限于在已经感染过口 疮病毒出现临床症状的羊群中使用，不可作为长期 预防使用，这是由于O R FV会表达多种免疫抑制蛋 白，造成机体的免疫抑制，增加了其他病原感染的 风险+2]。

国内更侧重O R FV灭活疫苗的研究，相较 于O R F V弱毒疫苗，O R FV灭活疫苗没有弱毒疫苗 可能降低机体免疫力的缺点，但灭活疫苗仅刺激机 体产生体液免疫应答，且需要多次免疫，免疫保护 效果较弱毒疫苗低，保护期也更短[3]。

由于O R F弱毒疫苗和灭活疫苗存在以上不足，有必要开发ORF 新型疫苗。

B2L蛋白是O R F V的主要囊膜蛋白，是ORFV 粒子囊膜的重要组成部分，是主要的保护性抗原之 一，可诱导机体产生中和抗体。

研究发现，O R FV感 染动物的血清抗体中和活性与B2L特异性抗体的 效价具有正相关性[4]。

原核表达的B2L完整蛋白纯 化后不稳定、保存期短。

为获得能代替B2L完整蛋白且保留B2L蛋白的主要抗原表位、易于纯化和保 存的B2L保护性抗原蛋白，在对ORFV B2L基因编 码抗原表位预测的基础上，构建包含B2L蛋白主要 抗原表位的截短重组蛋白的原核表达载体，并高效 表达了该截短重组蛋白HBBH,已证明该蛋白具有 良好的反应原性，并建立了基于该截短重组蛋白的 间接ELISA抗体检测方法。

该方法在特异性、灵敏 性和稳定性方面与基于O RFV完整B2L重组蛋白 的间接ELISA抗体检测方法一致:5]。

羊口疮病毒的 嗜上皮细胞特性致使被感染动物出现口腔病变的 特征性临床症状，推测特异性slgA是防御O RFV入 侵机体的重要抗体。

目前国内外未有关于O RFV黏膜抗体slgA的相关研究报道。

为进一步探究ORFV B2L截短重组蛋白HBBH是否具有作为亚单位疫 苗的潜力，本研究以不同剂量的HBBH不加或加不 同佐剂，经滴鼻或颈部皮下注射免疫BALB/c小鼠，共免疫3次，检测其刺激小鼠产生IgG、血清IgA和slgA三种O RFV抗体的能力。

1材料与方法
1.1试验材料
PET28-HBBH-BL21 和 pET30-pelb-LTB 原核 表达载体以及4株O RFV分离株均由西南民族大 学动物医学实验室构建和保存。

ORFV SEPEC 201
68中国兽医科学第51卷
佐剂组织灭活疫苗由西南民族大学制备并保存。

HRP标记的羊抗鼠lgG、IgA(a)购自博奥森公司。

1-Step Ultra TMB-ELISA Substrate Solution购自 Thermo公司。

Tween-20、牛血清白蛋白（BSA)购自 德国BioFroxx公司。

SPFBALB/c小鼠购自成都达 硕实验动物有限公司。

1.2 ORFVB2L截短重组蛋白HBBH和大肠杆菌热不稳定肠毒素L T B的表达
pET28-HBBH、pET30-pelb-LTB 表达载体质粒 分别转人BL21(DE3)感受态细胞后，工程菌在LB 培养基中以180 r/min振荡培养，至D eco值约为0.8, 分别在37 °C和18 °C条件下以终浓度1mmol/L的IPTG诱导过夜表达。

6 000 r/min离心20 min后收集 菌体沉淀，P B S洗涤2次，每100 m L培养物菌体沉 淀加10mLpH7.4P B S重悬，冰浴条件下超声破碎菌 体至样品不再黏稠时停止超声破碎，4 °C、10 000 r/min离心30 min后分别收集上清和沉淀，上清直接 收集，沉淀以8 mol/L尿素溶液重悬后收集。

1.3表达蛋白的纯化度为1:300。

分别以各时间点空白对照小鼠的血清 抗体ELISA检测D450值的平均值(幻+3倍标准差⑶ 设置为该检测时间点阳性临界值标准，即〇«〇值>又+3S判为阳性。

1.6细胞中和试验检测免疫小鼠的血清抗体
采用细胞中和试验对部分ORFV HBBH-ELISA 检测阳性的免疫小鼠血清进行检测，检测其对4株 O RFV分离株的中和效价。

2 结果
2.1 ORFVB2L截短重组蛋白HBBH和大肠杆菌热不稳定肠毒素LTB的原核表达
PET28-HBBH 和 pET30-pelb-LTB BL21(DE3) 工程菌经诱导表达的上清和超声破碎处理的沉淀 经SDS-PAGE电泳，结果HBBH以包涵体形式表达，L T B以可溶性形式表达，ORFV HBBH在约28 ku 处有明显条带，大肠杆菌L T B在约15 k u处有明显 条带（图1)。

表明成功表达了 ORFVB2L截短重组 蛋白HBBH和大肠杆菌热不稳定肠毒素LTB。

菌液离心上清液、菌体沉淀超声破碎后离心的 上清液和8 mol/L尿素溶液重悬的沉淀按照G E公 司His Trap HP(1 mL)手册纯化ORFV B2L截短重 组蛋白H BBH和大肠杆菌热不稳定肠毒素LTB, PET28-HBBH-BL21(DE3)纯化产物以梯度透析进 行复性。

1.4实验小鼠的分组及免疫
实验小鼠分为7组，每组5只。

其中第1组为空 白对照组，第2〜4组分别滴鼻HBBH 10 y g、20p g、30 p g,第 5 组滴鼻 HBBH 20 卩g+L T B20 Mg,第 6 组颈部皮下注射O RFV组织灭活疫苗（SEPEC201 佐剂）20p L,第7组颈部皮下注射BB H20fxg+ SEPEC201佐剂。

免疫组每组分别免疫3次,每次间 隔7 d，分别于第一次和第二次免疫前、第二次免疫 后7d以及第三次免疫后7d、14d眼眶采血分离血 清，最后一次采血后麻醉处死小鼠制备肺灌洗液（每 只约1mL)。

1.5免疫小鼠的抗体检测
ORFV HBBH-ELISA检测小鼠血清丨gG、IgA及 肺灌洗液SIgA的D4M值。

ELISA试验条件为HBBH 重组蛋白包被浓度5 M g/mL，包被条件为37 °C恒温 包被 2 h,含 5%BSA 的pH 7.4 的PBST(含 0.05% Tween-20 的 0_01 mol/L PBS)溶液封闭 30 min,— 抗温育60 min,酶标二抗温育60 min,底物作用15 min,小鼠血清稀释度为1 : 100,小鼠肺灌洗液稀释 度1 : 2,IgG二抗稀释度为1 : 2 000，lg A二抗稀释
M1 2 3 M 4 5 6
200 ku
150
75 ku
A B
图1ORFVHBBH(A)和大肠杆菌LTB(B)重组蛋白的表达 Figure 1Expression of recombinant proteins ORFV HBBH
(A) and E.coii LTB(B)
M:蛋白质分子质量标准；1、4:全菌；2、6:包涵体；3、5:上清。

M：Protein molecular weight Marker ；1,4 ：W h o l e bacterial protein ；2,6：Inclusion body protein ；3,5 ：Supernatant.
2.2纯化的ORFV B2L截短重组蛋白HBBH和大肠杆菌热不稳定肠毒素L T B的复性
HBBH和L T B重组蛋白携带His-tag,经His，ta g亲和层析柱纯化，12%SDS-P A G E电泳检测纯 化并梯度透析复性的HBBH。

结果显示，HBBH在约 56 ku、84 ku、112 ku等均出现目的条带，表明纯化复 性后的HBBH以二聚体或多聚体形式存在，纯化的 可溶性表达的L T B在约15 k u处有明显条带，与预 期的13.3 k u L T B重组蛋白大小相符，表明其复性 后以单体形式存在（图
2)。

第1期刘丽佳等：羊口疮病毒B2L截短重组蛋白刺激小鼠产生特异性抗体的研究69
和lO^gH BBH滴鼻组显著低于20 figHBBH+201
佐剂注射组(P<0.01);20 MgHBBH 和 30 fxgHBBH
滴鼻组与20 fxgHBBH+201佐剂注射组差异不显
著(P>0.1),结果详见表1、图3。

表明HBBH通过滴
鼻或颈部皮下注射均可刺激小鼠产生抗O RFV特异
性IgG抗体，20 ygH BBH+201佐剂注射免疫能最
大刺激小鼠血清IgG抗体的产生。

2.3.2 免疫小鼠血清中抗ORFV IgA抗体的ELISA
检测与空白对照组相比，各免疫组小鼠血清中
01^^匕八在一免后7(1即产生，20柯1^8[4+201
佐剂注射组小鼠的血清IgA在一免后7 d即上升到
所有组中最高；20 MgHBBH+L T B滴鼻组在一免后
7 d即上升，到二免后7 d上升到该组最高，略低于
20 ygH BBH+201佐剂注射组的最高值，但两组差
异不显著(P>0.1)，随后这两组血清IgA下降。

其余
各组均能刺激血清IgA的产生，除30 yg HBBH滴
鼻组外，均于二免后7 d上升到最高，至三免后14 d
下降接近未免疫组，结果详见表2、图4。

结果表明，
20 ygHBBH+L T B滴鼻较好地刺激了实验小鼠血
清IgA的产生，但难以维持较长时间。

2.3.3 免疫小鼠肺灌洗液中ORFVsIgA抗体的ELISA
检测实验小鼠三免后14d麻醉处死，取完整小鼠
肺制备的灌洗液特异性slgA，仅在滴鼻免疫的各组
中检测到（&彡0.1685判断为阳性，即对照组X=
0.117 5、S=0.017,阳性临界值标准彡+3S),且仅在
HBBH免疫量彡20 Mg的三组中可检测到。

其中30
Pg HBBH刺激实验小鼠产生了最高水平的slgA,在
同为20 ggH B B H滴鼻免疫时，L T B佐剂的加人能
刺激实验小鼠产生更高水平的sIgA(P<0.01)。

免疫
表1血清Ig G的D*)值
Table 10«> value of IgG in serum
免疫途径
免疫原
Immunogen 免疫前一免后7d二免后7d三免后7d三免后14 d
Immunization Before7 days post the7 days post the7 days post the14 days post the pathway immunization first immunization second immunization third immunization third i mmunization
对照组
Control group
0.627±0. 1030.627 土0.044 1.239 土0. 119 1.25 土0. 1181.20±0. M8
10 M g HBBH0.671 士0.1001. 110±0.123 1.926 土0.375 2.416 土0.362 2. 409 ±0.292
滴鼻
Nose dropping
20 /ig HBBH0.742 土0.098 1.234 土0.512 1.951±0. 284 3. 805 土0.028 3. 800 土0.018
30 M g HBBH0.640 ±0.0860.890 土0.093 2. 664 ±0. 124 3. 658 土0.273 3. 668±0.223
20 M g HBBH +
20 M g LTB
0. 590±0.051 1.033 土0.067 1.604±0. 283 1.613 土0.312 1.596 土0.292
灭活疫苗
颈部皮下注射Inactivated0.634 土0. 1210. 834±0. 189 2. 406 土0.240 3.835±0. 118 3. 855 土0. 108 Subcutaneous vaccine
injection of
neck and back20 y g HBBH +
201佐剂0.690 土0.079 3. 936 ±0.049 3. 949 土0.010 4. 000±0. 014 4. 000 土0.034
200ku
150 ku
100ku
75 ku
50 ku
37 ku
25 ku
15 ku
615 ku
A B
图2纯化复性的ORFVHBBH(A)和大肠杆菌LTB(B) Figure 2 Renaturation results of purified recombinant pro­teins ORFV HBBH (A)and E.coli LTB (B)
M:蛋白质分子质量标准；1:复性的纯化复性的纯化L T B。

M：Protein molecular weight Mar k e r；1.-Purified and renatured H B B H；
2 ：Purified and renatured LTB.
2.3免疫小鼠抗ORFV抗体IgG、血清丨gA和slgA 的ELISA检测
2.3.1 免疫小鼠血清中抗O RFV抗体IgG的ELISA 检测各试验组免疫小鼠血清IgG抗体ELISA检 测发现，滴鼻组与灭活疫苗组小鼠血清IgG在一免 后7 d即升高，二免后7 d升高到一定水平，三免后 7 d继续升高，三免后7 d所有免疫组小鼠的IgG抗 体均为阳性。

其中20 ng HBBH+201佐剂注射免疫 组一免后7d即达到最高水平。

2〇MgHBBH+LTB
70中国兽医科学第51卷
4.5004.0003.5003.000
I - 2.500
Q 2.000
1.500
1.000
0.500
3.8
3.668
3.855
2.409
1.2
rr i
_0
.596
D 免疫前 Before immuniza 丨ion
口D
:免后 7 d 7 days post the third immunization
O
D
E
组别Group
一免 frf 7 (1 7 days posl the firsl immunization 二免后 14 d 14 days post the thirdimmunization
Q 二免后 7 d 7 days post the second immunization
图3 IgG 增长规律
Figure 3 The law of IgG growth
A :对照组；
B :10 M g H B B H ;
C :20 M g H B B H ;
D :30 f t g H B B H ;
E :20 卩g H B B H + L T B ;
F :灭活疫苗；
G :20 M g
H B B H + 201 佐剂。

图 4、5 同。

A ：Control group ；B ： 10 ^g H B B H ；C ：20 ^g H B B H ；D ：30 ^g H B B H ；E ：20 H B B H +L T B ；F ：Inactivated vaccine ；G ：20 M g H B B H + adjuvant
201 .The s ame as Fig.4，Fig.5.
表2血清Ig A 的1\«…值
Table 2 IgA
value in serum
免疫途径
免疫原
Immunogen
免疫前
一免后7 d 二免后7d
三免后7d
三免后14 d
Immunization
Before 7 days post the 7 days post the 7 days post the 14 days post the pathway
immunization first immunization
second immunization
third immunization
third immunization
对照组
0. 181+0.032
0.205 + 0.0160.333 + 0.0320.293 + 0.0470.097 + 0.006Control group
10 M g HBBH 0. 154 ±0.0260.226 ±0.0910. 458 ±0. 1740.524 土 0.0470. 194 士 0.07520 M g HBBH
0. 170 土0.0300. 262 ±0. 1040.603±0. 1910.522 + 0. 1280.314 + 0. 047滴鼻
Nose dropping
30 M g HBBH
0. 165±0. 054
0.421 土 0.0870.312 土 0.0620.676 土 0. 1080. 254±0. 115
20 M g HBBH +
20 y g LTB
0.225 土 0.019
0.640 士 0. 185
0.724 士 0.081
0.43 土 0. 117
. 166±0. 106
颈部皮下注射
灭活疫苗
Inactivated 0. 172 土 0.0590. 227±0. 0130. 556±0. 0760.477 土 0. 1290. 174 土 0.046
Subcutaneous
vaccine injection of neck and back
20 ^tg HBBH +
201
佐剂
0. 203±0. Oil 0.798 士 0.0120.329 士 0.0570.403 ±0.0500. 117 土 0.023
D 免疫前 Before immunization D
r -免后 7 d 7 days post the Ihird immunization
0 =：免后 14 d 14 days posUhe third immunization
组别Group
口 --免后 7 d 7 days post the first immunization 〇 二免后 7 d 7 days postthe second immunization
图4 IgA 增长规律
Figure 4 The law of IgA growth
*::1
1
第1期刘丽佳等：羊口疮病毒B2L截短重组蛋白刺激小鼠产生特异性抗体的研究71
量彡20 Mg的slg A阳性数为8(n=15)，各组间slgA 的D450差异极显著（P<0.01)，与对照组差异极显著 (P C0.01)。

注射免疫无法激发slg A的产生，结果 详见表3、图5。

以上结果表明，一定量的HBBH+ L T B佐剂滴鼻免疫小鼠可更好地刺激小鼠slgA的产生。

2.4 ORFV IgG ELISA阳性抗体细胞的中和效价
ORFV HBBH-ELISA检测IgG阳性的免疫小鼠血清，经细胞中和试验检测其中和效价，结果d4S)值 2左右的免疫小鼠血清中和效价为1 : 16，而D450值 4左右的免疫小鼠血清中和效价高达1:128，且对 实验室保存的4株O RFV病毒株均具有中和活性。

表明ORFV B2L优势抗原表位截短重组蛋白HBBH 可刺激免疫小鼠产生高水平的中和抗体，且中和效 价与ELISA检测结果呈正相关。

表 3 肺洗液s l g A的值
T a b le 3s lg A v a lu e o f lu n g lo tio n
免疫途径
Immunization pathway
免疫原
Immunogen
阳性数(/j=5)
Positive number
(D45〇^0.168 5)
SlgA D450平均值
Average value
slgA D450标准差
Standard deviation
对照组
Control group
-0. 1180.017 0
10 M g HBBH-0. 1200.038 6滴鼻
20 M g HBBH20. 176*0. 009 9* Nose dropping30 M g HBBH3 1.971*0.042 8*
20 y g H B B H+
20 卩g LTB
30. 634*0•038 6*
颈部皮下注射
Subcutaneous injection of neck
灭活疫苗
Inactivated vaccine
-0. 1230.033 7
and back20 M g HBBH +20〗佐剂-0. 1200.067 4
标*者只统计阳性结果值。

If there i s* after the value,only the positive result value is counted.
组别G r o u p
图 5 s l g A检测结果
F ig u r e 5 s lg A test re s u lts
3讨论
目前在英国有两种获得完全许可的O RFV商 品化的弱毒活疫苗：Mallinckrodt Veterinary Ltd.生 产的 Scabivax ORF 和由 Willows Francis Veterinary 生产的Vaxall ORF,仅限于O RFV地方性流行的区 域使用。

这两种疫苗的免疫保护期都在4个月左 右，在暴发期间使用该弱毒疫苗可减轻O R F的临床 症状[6]。

O RF弱毒疫苗接种对于防止动物再次感染 是有限的，因此即使是弱毒疫苗，为了较长时间刺 激机体产生免疫，同样建议在流行地区要像使用灭 活疫苗一样，进行加强免疫[7$。

虽然O RFV弱毒疫 苗对羔羊的免疫保护率达到了 98%以上，但因其需 要多次股内侧划痕接种而不被多数养殖场采用[1D]。

国内更多采用痂皮组织灭活疫苗或细胞培养的O R FV灭活疫苗作为预防O R F的主要疫苗，但 O RFV灭活疫苗的保护率通常仅为60%左右。

由于 传统弱毒疫苗和灭活疫苗存在以上不足，新型疫苗 的研发成为必然。

新型疫苗主要包括DNA疫苗、病 毒活载体疫苗及亚单位疫苗等，DNA疫苗、病毒活 载体疫苗因其生物安全问题而一直停留在实验室 阶段，难以实现实际应用，亚单位疫苗安全好，易实 现规模化生产而受到青睐。

目前对于O RFV亚单位疫苗的开发多针对已 知的2种保护性抗原蛋白，即B2L囊膜蛋白和F1L 筛管蛋白[111。

其中ORFV059基因编码的B2L蛋白，
作为免疫保护性蛋白的同时还在病毒吸附细胞和病
72中国兽医科学第51卷
毒成熟的过程中发挥着作用。

冯平等12以昆虫表达 系统融合表达B2L及F1L并制备抗体，抗体中和效 价可达1 : 32以上，对融合表达的B2L及F1L蛋白 免疫的小鼠进行攻毒，免疫保护率可达70%。

张静 等™发现截短表达的B2L蛋白具有中和病毒的活 性。

本研究表达的ORFV B2L截短蛋白HBBH包括 了张静等13:制备的截短B2L蛋白的全部片段，同时 还融合了经生物信息学预测的B2L N端抗原表位 的更多片段。

HBBH免疫小鼠同样可刺激小鼠产生 高达1 : 128的细胞中和抗体，但没有研究其攻毒保 护率。

大肠杆菌不耐热肠毒素（LT)的B亚单位无毒 性且具有较强的佐剂活性，是一种黏膜免疫佐剂，它能刺激机体产生强烈的黏膜免疫应答，并调节 T h l和Th2型细胞因子的表达，增强特异性抗原刺 激机体产生分泌型slgA和血清lgGi14'。

O RFV具有 嗜上皮性，口腔黏膜上皮细胞是病毒人侵的主要靶 点，推测黏膜slgA是预防O RFV感染的有效抗体之 一，关于O RFV的slg A国内外未见相关研究报道。

本研究对ORFV B2L截短蛋白HBBH作为亚单位 抗原激发实验小鼠特异性黏膜slgA、血清Ig G和IgA的能力进行了初步研究。

研究结果显示，通过颈 部皮下注射20 M g HBBH蛋白+201佐剂可高效刺 激小鼠产生特异性IgG抗体，在-•免后7 d即达到 最大值，且最大值与组织灭活疫苗的免疫效果差异 不显著。

而不同量的HBBH蛋白（10n g、20y g和30 y g)滴鼻免疫不加佐剂组与灭活疫苗注射免疫 刺激机体产生特异性IgG的效果相近，均需多次免 疫才能使丨g G抗体达到较高水平。

另外20 p g HBBH+黏膜免疫佐剂L T B滴鼻免疫小鼠的IgG最 大值明显低于其他免疫组，造成这-结果的原因仍需进一步分析。

作为对照组的小鼠也出现了血清特 异性IgG升高的情况，这可能是由于实验小鼠词养 管理及免疫操作引起的，比如饲养隔离不充分或是 滴鼻操作时小鼠打喷嚏等原因所致，但所幸的是并 未影响阴阳性的判定。

各试验组血清IgA在一免后7 d即产生，20 M g HBBH+L T B滴鼻组与20卩g HBBH+201佐剂注 射组的IgA在一免后7 d即升高到最大值，但与其 他组一样，在二免后7 d开始下降，加强免疫未能阻 止下降趋势，直至三免后14 d下降至接近未免疫水 平。

可见HBBH刺激小鼠短暂产生特异性血清IgA,血清丨g A难以作为长时间保护机体的血清抗体。

要 使HBBH有效刺激机体产生黏膜免疫作用，需要对 HBBH的免疫剂量、免疫途径和是否加佐剂等进行比较研究，以筛选出最佳的免疫剂量、免疫途径和
免疫佐剂。

本研究设计了不同免疫剂量HBBH、滴鼻
或注射免疫途径、加或不加人免疫佐剂对实验小鼠
进行分组免疫，三免后14 d检测，特异性slg A仅在
每次免疫量彡20 Hg的滴鼻免疫的三个组中检测到，这三组的15只小鼠中仅有8只产生了 slgA(8/15),
且三组间两两比较slg A的D45〇差异极显著（P<
0.01)。

30 yg 的HBBH 免疫量优于 20 M g的HBBH
免疫量，可更好地刺激小鼠产生slgA，20 figHBBH+
20 M g L T B佐剂免疫优于20 yg HBBH单独免疫。

以上研究结果表明，一定剂量的HBBH中加人黏膜
佐剂通过滴鼻途径能更好地刺激小鼠的黏膜免疫。

在相同处理的各免疫组中，有的免疫小鼠能检测到 slgA,有的却不能，分析原因除小鼠个体差异外，本
研究免疫接种时，小鼠打喷嚏、咳嗽及免疫抗原直
接进人口腔等可能对免疫结果造成了一定的影响，这是实验中需要改进的地方。

综上分析，HBBH具有作为亚单位疫苗的潜力。

以小鼠作为被免疫的实验动物，无佐剂情况下，可
通过滴鼻较高剂量免疫[彡30 Hg/(次•只）]，在三免
后刺激机体产生较高水平的IgG与slgA;加人LTB
佐剂，通过滴鼻较高剂量免疫[多20 yg/(次•只）],
也可在三免后刺激机体产生较高水平slgA,但IgG
最高水平较无佐剂更高抗原剂量组要低；加入201
佐剂，通过颈部皮下注射免疫20 ng HBBH,在1免
后7d可快速刺激机体产生IgG至最高水平，但不会
刺激机体产生slgA。

能否刺激机体产生中和抗体是评价疫苗免疫
效果的重要指标。

本研究对HBBH-EL1S A检测阳性
的免疫小鼠血清进一步采用细胞中和试验以检测
其中和效价，结果HBBH-ELISA检测阳性的免疫小
鼠血清的中和效价与HBBH-ELISA的D45〇值呈正
相关，表明ORFV B2L截短重组蛋白HBBH能刺激
机体产生中和抗体，且中和抗体效价高于冯平等— 的报道。

本研究为ORFV B2L优势抗原表位截短重
组蛋白作为亚单位疫苗提供了数据支持。

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(责任编辑何知宇）。